【摘要】： 研究背景 近年來的流行病學統(tǒng)計和實驗研究均提示：低出生體重不僅是造成圍產兒死亡和發(fā)病的重要原因之一，而且還是成年后心血管疾病、糖代謝異常等代謝綜合征(metabolic syndrome, MS)的獨立發(fā)病因素。因而研究低出生體重引起成年后MS的機制，以及實施成年期疾病的早期防治已成為一個研究熱點。圍生期發(fā)育中的許多器官都會經歷一個重構(remodeling)的過程，此時期器官細胞的增殖、凋亡均處于動態(tài)變化中，且存在干細胞的分化再生。內分泌胰腺—胰島的發(fā)育同樣存在重構，且已證實胎兒期和生后早期是胰島重構的關鍵時期，此后胰島的結構和功能已被“程序化”，對血糖的自穩(wěn)態(tài)將產生終生的影響。營養(yǎng)素是基因表達的重要調節(jié)因子，它可通過控制代謝產物或代謝狀態(tài)導致mRNA、蛋白質合成與功能改變。在胰腺發(fā)育的關鍵時期對營養(yǎng)不良敏感，充足的營養(yǎng)對維持發(fā)育期胰島的正常形態(tài)功能是必要的。作為一種發(fā)育期重要的必需氨基酸—�；撬幔诘统錾w重兒是明顯缺乏的。有研究表明�；撬峋哂幸葝u素樣生物效應，參與維持機體葡萄糖自穩(wěn)態(tài)；作為內源性細胞保護劑，它還能保護胰島β細胞的內分泌功能。但國內尚未見有關�；撬釋ι笤缙谝葝u重構影響的研究。�；撬峥纱龠M神經細胞增殖分化；并能通過抑制巨嗜細胞內iNOS的活性達到抑制巨嗜細胞凋亡的作用。但是關于牛磺酸對胰島細胞增值、凋亡以及再生分化影響的研究亦甚缺乏。 目的 (1)本實驗試給予孕鼠10％低蛋白飲食，觀察所生仔鼠數目、平均體重、IUGR發(fā)生率及圍產期死亡率，檢驗該方法是否適用于制造低出生體重仔鼠模型。(2)研究低出生體重仔鼠生后早期階段體重、血糖水平、血胰島素水平、胰島β細胞量(βcell mass, BCM)和β細胞超微結構的變化。(3)進一步從胰島細胞增殖、凋亡和分化三方面，探討�；撬釋Φ统錾w重仔鼠胰島重構的影響及其有效機制。 方法 (1)低出生體重仔鼠模型的建立和實驗分組：采用健康三月齡SD二級雌性和雄性大鼠各40只，，按照雌雄1∶1的比例同一籠中交配。將孕鼠分成四組：①給予孕期母鼠10％低蛋白飼料(R組)制造低出生體重仔鼠模型，并在21天哺乳期持續(xù)該飼料喂養(yǎng)；②對照組(C組)母鼠給予21％正常蛋白飼料喂養(yǎng)；③在21天哺乳期給予部分10％低蛋白飼料喂養(yǎng)的母鼠富含2.5％�；撬犸嬘盟M行營養(yǎng)干預(RT組)；④給予部分21％正常蛋白飼料喂養(yǎng)的母鼠富含2.5％�；撬犸嬘盟M行對照營養(yǎng)干預(CT組)；其它母鼠自由飲水。觀察R和C組新生仔鼠數目、平均體重、IUGR發(fā)生率及圍產期死亡率。 (2)胰島功能和結構的變化：①于生后1、7、14、21天取仔鼠稱體重、取血測血糖和胰島素值。②并取出胰腺備做電鏡標本，電鏡下觀察胰島β細胞的超微結構。③免疫組化方法檢測胰島素(insulin)蛋白在胰腺中的表達，并計算β細胞量(BCM=胰島素陽性面積／胰腺總面積×胰腺重量)。 (3)�；撬岣深A后胰島重構相關指標的檢測：①免疫組化方法檢測BrdU在胰島中的表達，計算增殖指數(proliferation index, PI)；②末端轉移酶介導的dUTP缺口末端標記法(TUNEL)檢測胰島細胞凋亡情況，計算凋亡指數(apoptosis index, AI)；③RT-PCR方法檢測胰腺組織insulin和胰十二指腸同源盒基因-1(PDX-1)mRNA表達量。采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。多個樣本均數間的兩兩比較采用單因素方差分析中的最小顯著差異法(LSD)，P＜0.05視為差異有顯著性。 結果 (1)建立低出生體重仔鼠模型：10％低蛋白飼料喂養(yǎng)孕鼠，可使其仔鼠出生體重下降，且較多達到IUGR標準；而每窩產仔數和圍生期死亡率無明顯變化。 (2)胰島功能和結構的變化：①各組各時間點的血糖和胰島素水平無顯著性差異。②各組仔鼠的胰島BCM均隨日齡增加而增加；R組仔鼠各時間點的BCM均顯著低于于C組。③生后1天時，R組整個胰腺組織中β細胞少見；β細胞的內分泌顆粒分布不均勻結構不完整；生后21天時，R組仔鼠β細胞中內分泌顆粒的大小和分布不如C組均勻，且可見較多蒼白顆粒和脫顆�，F象。 (3)牛磺酸干預后胰島重構相關指標的檢測：①經生后給予�；撬�，RT組于生后7、14、21天出現輕微的生長追趕現象。②經生后早期補充牛磺酸，21天時RT組β細胞中內分泌顆粒的大小和分布較R組均勻，蒼白顆粒和脫顆粒現象較R組也少見，但仍未恢復至C組正常形態(tài)；CT組與C組的超微結構相似。③各組仔鼠的胰島insulin mRNA表達和BCM均隨日齡增加而增加；RT組仔鼠各時間點的insulin mRNA和BCM均顯著高于R組，接近C組和CT組。④各組仔鼠的胰島細胞PI均隨日齡增加而下降；RT組PI均顯著高于R組，接近C組和CT組水平。⑤各組仔鼠的胰島細胞AI在生后21天內經歷了動態(tài)變化，RT組的AI較R組下降，但仍高于C和CT組。⑥各組仔鼠的胰腺PDX-1 mRNA表達均隨日齡增加而下降；RT組仔鼠各時間點的PDX-1 mRNA表達均顯著高于R組，接近C組和CT組水平。 結論 (1)10％低蛋白飼料喂養(yǎng)孕鼠，是一種有效的制造低出生體重仔鼠模型的方法。(2)生后21天內，低出生體重仔鼠尚未出現血糖和胰島素異常，但是胰島結構已發(fā)生變化(包括BCM下降和β細胞超微結構改變)。(3)生后早期補充牛磺酸未對低出生體重仔鼠的生長追趕起顯著作用；但可以通過減緩胰島細胞增殖下降的趨勢、減少胰島細胞凋亡和促進β細胞的定向分化三方面機制，增加低出生體重仔鼠的胰島BCM，最終達到改善胰島重構的效應。
【圖文】：

圖1一1:新生鼠的胰腺解剖結構圖Figurel一l:AnatomicaleonfigurationofPanereasinneonatalrat1一肝臟;2一小腸;3一胃;4一胰腺;5一脾臟l一1iver;2一smallintestine;3一stomaeh;4一Panereas;5一sPleen、檢測內容及方法:(一)、體重和胰腺重量:禁食1小時后稱體重，解剖動物完整分離胰記錄。(二)、血糖:禁食1小時后，用羅氏血糖儀測全血的快速血糖，并記(三)、放射免疫法(radioimmunoassa蘇RIA)檢測血胰島素水平:1、將待測血清標本自然解凍并升至室溫，取質控血清I、H和待測0“l(fā)于試管內。2、用微量移液器取100pl抗血清(第一抗體)，在旋渦混合器上充分于恒溫水浴箱內溫育(37℃溫育60分鐘)。

2、仔鼠體重:本實驗通過母鼠低蛋白飲食法成功建立了宮內營養(yǎng)不良的低出生體重仔鼠模型。生后第1天時，R組仔鼠體重為6.24土0.52克，顯著低于C組仔鼠的7.68士0.41克(尸=0.002)(見圖1一2)。之后各組仔鼠體重雖然均逐步增加，但R組仔鼠體重始終低于C組。第21天時R組仔鼠明顯瘦小，皮毛稀疏，毛色無光澤;C組仔鼠皮毛豐密，毛色有光澤。圖1一2:生后第1天的R組和C組新生仔鼠 Figurel一 2:neonatalratsofgrouPRandCatPostnataldaylleft一 neonatalratingrouPR(Wt5.859);right一 neonatalratingrouPC(Wt7.509)3、IUGR發(fā)生率:以C組仔鼠的平均體重減兩個標準差(即6.86克)，作為界定IUGR的標準，低于6.86克者判定為IUGR仔鼠。R組獲得的IUGR仔鼠為97只，C組獲得IUGR仔鼠僅9只。R組IUGR發(fā)生率為66.4%
【學位授予單位】：中南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2006
【分類號】：R722

【參考文獻】

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本文編號：2695540