【摘要】： 前言 發(fā)育性髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良(developmental displysia of the hip，DDH)是小兒骨科常見(jiàn)的髖關(guān)節(jié)發(fā)育障礙性疾病，發(fā)病率1-1.5‰，目前病因不明。以往的研究發(fā)現(xiàn)DDH患兒多伴有全身關(guān)節(jié)松弛，這與髖脫位術(shù)中所見(jiàn)松弛薄弱的髖關(guān)節(jié)囊與圓韌帶相符。因此髖關(guān)節(jié)松弛是導(dǎo)致髖脫位主要因素之一也得到了普便認(rèn)同。 關(guān)節(jié)過(guò)度活動(dòng)或關(guān)節(jié)松弛目前認(rèn)為是一種疾病并已得到兒科及骨科醫(yī)師的重視，它可發(fā)生在單個(gè)關(guān)節(jié)或是全身性的。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為它是由基因決定的結(jié)締組織松弛所造成的，特別是對(duì)關(guān)節(jié)囊和韌帶的影響。目前已知的3個(gè)經(jīng)典的與基因有關(guān)的膠原疾病有：1)馬凡氏綜合癥：是原纖維蛋白基因FIB 1和FIB 2的突變；2)成骨不全：有200多種獨(dú)立突變發(fā)生在COL 1a1和COL1a2；3)Ehlers-Danlos綜合癥：約有80種突變發(fā)生在COL 3a1。因此有許多學(xué)者推測(cè)DDH可能是一種發(fā)生在結(jié)締組織的可遺傳的疾病，很可能與某些細(xì)胞外基質(zhì)成分有關(guān)，如膠原、彈力纖維等。人類(lèi)出生時(shí)髖臼較淺，股骨頭表面為平滑弧線，出生后髖臼不斷加深，股骨頭弧度加大，髖關(guān)節(jié)逐漸穩(wěn)定，而這需要頭臼同心的相互作用才能達(dá)到。而關(guān)節(jié)囊和圓韌帶則具有保持這種頭臼同心位置重要的作用。 膠原纖維及小分子蛋白多糖是關(guān)節(jié)囊和圓韌帶的主要成分，并發(fā)揮著重要的抗張力生物學(xué)作用。以往關(guān)于DDH關(guān)節(jié)囊及圓韌帶中膠原纖維的研究有過(guò)少量報(bào)道但結(jié)果迥異，多停留在組織形態(tài)水平。本研究以DDH患兒髖關(guān)節(jié)囊和圓韌帶為研究對(duì)象，應(yīng)用免疫組織化學(xué)法觀察Ⅰ、Ⅲ型膠原在髖關(guān)節(jié)囊和圓韌帶的分布與定位；應(yīng)用分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)比較Ⅰ、Ⅲ型膠原和兩種小分子蛋白多糖(Biglycan和Decorin)在轉(zhuǎn)錄水平和(或)蛋白水平的表達(dá)差異。試圖從分子水平揭示DDH患兒髖關(guān)節(jié)松弛的機(jī)理，是關(guān)節(jié)松馳導(dǎo)致DDH理論的一次深入探索。 材料與方法 一、標(biāo)本采集及處理 發(fā)育性髖脫位髖關(guān)節(jié)囊標(biāo)本33例，來(lái)源方式：手術(shù)復(fù)位中經(jīng)緊縮后切除的髖關(guān)節(jié)上方多余關(guān)節(jié)囊。對(duì)照組兒童髖關(guān)節(jié)囊標(biāo)本17例。在DDH組選擇與對(duì)照組性別相同，年齡相近的9例患兒與對(duì)照組配對(duì)。 發(fā)育性髖脫位髖關(guān)節(jié)圓韌帶標(biāo)本20例，來(lái)源方式：手術(shù)復(fù)位中切除的患髖圓韌帶。對(duì)照組兒童圓韌帶標(biāo)本10例。在DDH組選擇與對(duì)照組性別相同，年齡相近的6例患兒與對(duì)照組配對(duì)。 剪取標(biāo)本為多個(gè)小組織塊：部分置于4％多聚甲醛溶液中室溫固定24小時(shí)，脫水，透明，石蠟包埋，制成5μm切片；部分置于Eppendorf管中，-80℃深低溫保存。 二、實(shí)驗(yàn)方法及檢測(cè)指標(biāo) (一)免疫組織化學(xué)法(SABC法) 觀察Ⅰ、Ⅲ型膠原在DDH患兒髖關(guān)節(jié)囊及圓韌帶中的定位與分布，半定量測(cè)定Ⅰ、Ⅲ型膠原含量。 (二)髖關(guān)節(jié)囊及圓韌帶中Ⅰ、Ⅲ型膠原和兩種小分子蛋白多糖(Biglycan和Decorin)轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè) 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR)測(cè)定COL1a1、COL3a1、Biglycan和Decorin mRNA水平表達(dá)。 (三)髖關(guān)節(jié)囊及圓韌帶中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白水平檢測(cè) 免疫印跡雜交技術(shù)(Western-Blot)檢測(cè)COL1a1、COL3a1蛋白水平表達(dá)。 三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，p＜0.05視為統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著差異。應(yīng)用Pearson法進(jìn)行相關(guān)分析，配對(duì)比較采用配對(duì)T檢驗(yàn)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 一、Ⅰ、Ⅲ型膠原的定位、分布與含量 (一)關(guān)節(jié)囊 1、Ⅰ型膠原 貼近關(guān)節(jié)側(cè)的滑膜層呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，成纖維細(xì)胞及膠原纖維平行滑膜緣排列規(guī)整。纖維層陽(yáng)性表達(dá)有所減弱，膠原纖維排列波浪樣、多級(jí)性，成纖維細(xì)胞散布其間。在性別相同，年齡相近的9例配對(duì)比較中，纖維層中有陽(yáng)性表現(xiàn)的成纖維細(xì)胞數(shù)占總計(jì)數(shù)成纖維細(xì)胞的百分比及膠原染色的灰度值在髖脫位組與對(duì)照組間存在顯著差異(p＜0.05) 2、Ⅲ型膠原 僅在DDH組纖維層中出現(xiàn)3例大齡女性患兒陽(yáng)性反應(yīng)：2例為成纖維細(xì)胞周?chē)霈F(xiàn)環(huán)繞棕色深染；1例為細(xì)胞外基質(zhì)網(wǎng)狀棕色深染。 (二)圓韌帶 1、Ⅰ型膠原 貼近外周的圓韌帶鞘呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，膠原纖維平行滑膜緣排列規(guī)整。內(nèi)部纖維層陽(yáng)性表達(dá)有所減弱，膠原纖維排列波浪樣、多極性，成纖維細(xì)胞散布其間。在性別相同，年齡相近的6例配對(duì)比較中，纖維層中有陽(yáng)性表現(xiàn)的成纖維細(xì)胞數(shù)占總計(jì)數(shù)成纖維細(xì)胞的百分比及膠原染色的灰度值在DDH組與對(duì)照組間存在顯著差異(p＜0.05)。 2、Ⅲ型膠原 DDH組與對(duì)照組均未見(jiàn)陽(yáng)性反應(yīng)。 二、Ⅰ、Ⅲ型膠原和兩種小分子蛋白多糖(Biglycan和Decorin)mRNA表達(dá)差異 (一)關(guān)節(jié)囊 COL1a1、COL3a1、Biglycan和Decorin mRNA在DDH組表達(dá)較正常對(duì)照組降低(p＜0.01)。 (二)圓韌帶 COL1a1、Biglycan和Decorin mRNA在DDH組表達(dá)較正常對(duì)照組降低(p＜0.01)。COL3a1無(wú)顯著差異(p＞0.05)。 三、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)差異 (一)關(guān)節(jié)囊 COL1a1蛋白含量在DDH組較正常對(duì)照組降低(p＜0.01)。COL3a1無(wú)顯著差異(p＞0.05)。 (二)圓韌帶 COL1a1蛋白含量在DDH組較正常對(duì)照組降低(p＜0.01)。COL3a1無(wú)顯著差異(p＞0.05)。 結(jié)論 一、嬰兒期至青春期前DDH患兒髖關(guān)節(jié)囊及圓韌帶中旺盛分泌Ⅰ型膠原的成纖維細(xì)胞的比例較正常同性同齡兒減小，提示DDH患兒Ⅰ型膠原合成能力下降。 二、DDH患兒髖關(guān)節(jié)囊及圓韌帶中Ⅰ型膠原在mRNA及蛋白水平表達(dá)較正常同性同齡兒降低，可能是導(dǎo)致DDH患兒髖關(guān)節(jié)松弛的主要原因。 三、DDH患兒髖關(guān)節(jié)松弛可能與Ⅲ型膠原含量無(wú)關(guān)。 四、雙糖鏈蛋白多糖(Biglycan)和核心蛋白聚糖(Decorin)mRNA在DDH患兒髖關(guān)節(jié)囊及圓韌帶的表達(dá)降低，二者很可能參與DDH的髖關(guān)節(jié)松馳機(jī)制。
【圖文】：

成纖維細(xì)胞及I型膠原纖維平行滑膜緣排列規(guī)整(400x)

型膠原在兒童髓關(guān)節(jié)囊的分布，，滑膜層表達(dá)強(qiáng)于纖維層(100X)
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類(lèi)號(hào)】：R726.8

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本文編號(hào)：2691640