【摘要】： 新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE)是指圍產(chǎn)期窒息缺氧導致腦的缺氧缺血性損害,而出現(xiàn)的一系列中樞神經(jīng)異常的表現(xiàn)(新生兒學組,2005),是圍產(chǎn)期足月兒腦損傷的最常見原因(Triulzi,2006),常可引起不可逆的組織損傷,從而引起腦癱、癲癇、智力低下等嚴重后遺癥,給家庭社會帶來沉重的負擔。雖然目前HIE的發(fā)病機制研究取得了很大進展,但臨床上仍以對癥、支持、綜合治療為主,缺少特異性治療的方法,因此,尋找一種治療HIE行之有效的方法是一件十分有意義的事。 干細胞治療與高壓氧(hyperbaric oxygen,HBO)治療是目前認為比較有效的兩種治療方法。干細胞技術(shù)在最近幾年取得了重大突破,并已成為國內(nèi)外生物及醫(yī)學領域研究中的熱點。干細胞治療又可分為內(nèi)源性NSCs(Neural stem cells,NSCs)原位激活和外源性干細胞移植兩大類,內(nèi)源性NSCs沒有外源性干細胞帶來的免疫排斥、倫理學道德問題,更適合于臨床運用。內(nèi)源性NSCs終生存在于側(cè)腦室室管膜下區(qū)(subventricular zone,SVZ)和海馬齒狀回(dentategyrus,DG)等腦內(nèi)某些特定的區(qū)域(Gage,2000),當損傷發(fā)生時這些內(nèi)源性NSCs可被激活,對損傷的腦組織起到修復作用(Maslov,2004)。已有人報道,新生大鼠在缺氧缺血性腦損傷(hypoxic—ischemic brain damage,HIBD)后腦內(nèi)源性NSCs有增殖和分化現(xiàn)象(Hayashi,2005)。但大腦自身的這種修復能力畢竟是有限的,如果能夠設法擴大機體的這種自身修復能力將為干細胞治療帶來廣闊的前景(Felling,2006)。 HBO作為目前一種比較有效的治療方法,用于治療新生兒疾病,特別是HIE已有多年歷史,但由于缺乏科學的理論依據(jù)和對毒副作用的誤解,在臨床應用中有爭議。目前多數(shù)動物研究認為HBO對HIE治療有效,可減輕神經(jīng)元損傷,促進遠期功能的恢復(Badr,2001;Calvert,2002;Calvert,2003;Veltkamp,2004);國內(nèi)大量臨床報道也表明HBO可以降低HIE的傷殘率和病死率(胡電,2004:蓋勇,2005)。我們最近的實驗發(fā)現(xiàn)(余小河,2006)HBO治療HIBD新生大鼠時,腦內(nèi)內(nèi)源性NSCs有增多的現(xiàn)象,提示HBO的治療作用可能與激活內(nèi)源性NSCs的增殖有關(guān),但其增殖的過程、分化為何種神經(jīng)細胞以及這些增殖的細胞能否遷移到腦損傷部位并真正起到代償作用等問題,目前尚不清楚。如能弄清楚這些問題將為HBO治療HIBD提供可靠的理論依據(jù)。 治療時間窗是影響HBO療效的重要因素,人們在HBO治療成體大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型的時間窗方面已做了大量的研究(Lou,2004;Badr,2001),認為腦損傷后6小時內(nèi)HBO治療,可有效減輕梗死灶并能改善遠期行為學,但是由于新生大鼠處于發(fā)育階段,其研究較為復雜,在HBO治療新生大鼠HIBD的時間窗方面的研究甚少。根據(jù)成年大鼠MCAO模型的研究結(jié)果,HBO必須在發(fā)病后的6小時內(nèi)開始治療才有效(Bard,2001;Yin,2002;Lou,2004;Zhang,2005),然而這6小時的時間窗太短,在臨床上很難在起病后的6小時內(nèi)即開始HBO治療,因此限制了HBO治療在新生兒HIE中的廣泛應用。故探討HBO治療HIBD的時間窗具有重要意義。 Wnt信號與神經(jīng)發(fā)生密切相關(guān),Wnt信號的激活可以促進NSCs的增殖與分化(Inoue,2006;Hirabayashi,2005;Inoue,2004;Lie,2005),研究還發(fā)現(xiàn)Wnt途徑參與腦損傷后損傷組織的修復(Chong,2004),故推測:HBO治療促進內(nèi)源性NSCs的增殖是否與Wnt信號有關(guān)呢?解決這一問題將為HBO治療HIBD新生大鼠提供有力的理論依據(jù),并為更好地促進NSCs增殖治療HIBD指明方向。本實驗分為以下三部分: 一、高壓氧治療促進缺氧缺血性腦損傷新生大鼠內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的增殖、遷移與分化 目的:探討HBO治療對HIBD新生大鼠腦內(nèi)源性NSCs增殖、遷移及分化的影響,為HBO治療的臨床應用提供理論依據(jù)。 方法:7日齡Sprague-Dawley新生大鼠隨機分為正常對照(CON)組,缺氧缺血腦損傷組(HIBD)及高壓氧組(HBO治療:壓力為2個絕對大氣壓,穩(wěn)壓1 h,每日一次,連續(xù)7天)。采用經(jīng)典的Rice-Vannucci法制成HIBD模型,HBO組在HIBD后3 h內(nèi)進行HBO治療。分別于HIBD后6 h,24 h,3 d,7 d,14 d,采用BrdU/nestin免疫熒光雙標法動態(tài)檢測缺血側(cè)側(cè)腦室室管膜下區(qū)(subventricular zone,SVZ)、海馬齒狀回(dentate gyrus,DG)增殖的內(nèi)源性NSCs的動態(tài)變化。Westem blotting法檢測缺血側(cè)大腦半球nestin蛋白的動態(tài)變化。BrdU/DCX免疫熒光雙標法檢測SVZ區(qū)增生的未成熟神經(jīng)元及其腦損傷區(qū)的遷移;BrdU/β-tubulin,BrdU/GFAP,BrdU/O_4免疫熒光雙標法檢測大腦皮層新生的神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞,并計算各新生神經(jīng)細胞的分化比率。HIBD后28d,采用HE與Nissl染色法檢測腦組織的病理變化,并應用免疫組化法檢測胼胝體、紋狀體髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein,MBP)的表達。 結(jié)果:HBO組SVZ區(qū)與DG區(qū)BrdU~+Nestin~+細胞分別于HIBD后6 h與24 h顯著增加,7 d時達所觀察時間點的最高水平,并顯著多于各對照組(P＜0.01),14 d時,BrdU~+Nestin~+細胞數(shù)開始下降,仍多于各對照組(P＜0.01);nestin蛋白的Western Blotting分析發(fā)現(xiàn)缺血側(cè)大腦半球nestin蛋白于HIBD后24 h開始增加,HIBD后7 d達最高水平,后下降;HIBD后7 d,HBO組SVZ區(qū)BrdU~+ DCX~+細胞表達顯著增加且高于CON組與HIBD組(P＜0.05),14 d時SVZ區(qū)表達減少,同時在缺血側(cè)大腦皮層發(fā)現(xiàn)BrdU~+ DCX~+細胞,占皮層BrdU~+細胞的72.4±6.2%,顯著多于對照組(P＜0.01;F=13.11);HIBD后28 d,HBO組缺血側(cè)大腦皮層神經(jīng)元分化比率與少突膠質(zhì)細胞分化比率均高于對照組(P＜0.05),星形膠質(zhì)細胞的分化比率較低,HBO組缺血側(cè)大腦神經(jīng)元及髓鞘損傷明顯減輕。 結(jié)論:高壓氧可以促進HIBD新生大鼠內(nèi)源性NSCs的增殖,增殖的NSCs遷移至損傷側(cè)的大腦皮層,并分化成為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞及少突膠質(zhì)細胞,修復腦損傷。 二、高壓氧治療新生大鼠HIBD的時間窗 目的:從HBO治療促進內(nèi)源性NSCs增殖的角度探討HBO治療新生大鼠HIBD的最佳時間窗。 方法:采用經(jīng)典的Rice法制成HIBD模型。7日齡Sprague-Dawley新生大鼠隨機分為正常對照(CON)組,缺氧缺血腦損傷組(HIBD)及高壓氧組(HBO,其治療方法同前),HBO治療組HBO開始治療的時間分為5個亞組:1)HBO-3 h組、2)HBO-6h組、3)HBO-12 h組、4)HBO-24 h組、5)HBO-72 h組,每亞組20只。HIBD后10 d,BrdU/nestin免疫熒光雙標法檢測各組大腦SVZ區(qū)內(nèi)源性NSCs的增殖情況,Western-blotting法檢測各組nestin蛋白的表達變化;至22日齡開始對各組動物進行T迷宮試驗、放射性迷宮測試、足錯誤行為學測試;行為學結(jié)束后,尼氏染色法檢測每馬CA1區(qū)錐體細胞密度變化。 結(jié)果:BrdU/nestin免疫熒光雙標結(jié)果發(fā)現(xiàn):HIBD后24 h內(nèi)給予HBO治療,SVZ區(qū)有大量的BrdU~+nestin~+細胞,即新增殖的內(nèi)源性NSCs,以3 h內(nèi)HBO治療組增殖最明顯(128±16個/mm~2)。與此同時,Western blotting法檢測缺血側(cè)(左側(cè))腦nestin蛋白的表達,發(fā)現(xiàn)HIBD后24 h內(nèi)給予HBO治療,nestin蛋白表達顯著高于HIBD組;T迷宮試驗、放射性迷宮測試、足錯誤測試結(jié)果均表明HIBD后12 h內(nèi)給予HBO治療組均療效顯著;尼氏染色法顯示HIBD后12 h內(nèi)HBO治療,海馬CA1區(qū)神經(jīng)元丟失較HIBD組顯著減少。 結(jié)論:HBO治療時間窗延長至HIBD后12 h仍可促進內(nèi)源性NSCs增殖,減輕神經(jīng)元損傷;延長至72 h以后,HBO治療療效不顯著。 三、高壓氧治療通過Wnt信號途徑促進HIBD新生大鼠腦內(nèi)NSCs的增殖 目的:檢測HBO治療后HIBD新生大鼠內(nèi)源性NSCs與Wnt信號途徑重要蛋白Wnt-3、β-catenin蛋白的動態(tài)變化,并進行其相關(guān)性研究,從而探討HBO促進內(nèi)源性NSCs增殖的機制。 方法:7日齡SD新生大鼠采用經(jīng)典的Rice法制成缺氧缺血腦損傷(HIBD)模型,結(jié)扎左側(cè)頸總動脈,8%O_2缺氧2 h,在HIBD后3 h內(nèi)給予HBO治療。免疫熒光雙重染色法動態(tài)檢測HIBD后6h,24 h,3 d,7 d,14 d,新生大鼠缺血側(cè)室管膜下區(qū)(Subventriculaurzone,SVZ)nestin/Wnt-3,nestin/β-catenin蛋白的表達,激光共聚焦顯微鏡分析其熒光強度,并分別行Wnt-3與nestin,β-catenin與nestin熒光強度的相關(guān)性分析;western-blotting法檢測缺血側(cè)腦組織各時間點nestin,Wnt-3,β-catenin總蛋白及β-catenin核蛋白的表達。 結(jié)果:免疫熒光雙標結(jié)果發(fā)現(xiàn):各組SVZ區(qū)均可見nestin~+Wnt-3~+及nestin~+β-catenin~+細胞。HIBD后6 h,HBO治療組NSCs(nestin~+細胞)的細胞膜可見Wnt-3蛋白表達開始增加,HIBD后3d,5 d,7 d Wnt-3蛋白達較高水平,顯著高于對照組(P＜0.05),HIBD后14 d,Wnt-3蛋白表達顯著減少(P＜0.01);HIBD后24 h,HBO治療組NSCs(nestin~+細胞)內(nèi)β-catenin蛋白表達開始增加,主要位于胞漿表達,僅見少量胞核表達,HIBD后3 d,胞質(zhì)內(nèi)β-catenin蛋白積聚、活化并開始向細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移,HIBD后5 d,7 d細胞核內(nèi)β-catenin蛋白維持較高水平并顯著高于對照組(P＜0.01),HIBD后14 d,β-catenin蛋白表達顯著減少;HBO治療組nestin蛋白于HIBD后24 h表達開始增加,HIBD后7 d達較高水平,顯著高于對照組(P＜0.05),后下降。HBO治療組nestin蛋白熒光強度分別與Wnt-3及β-catenin蛋白熒光強度呈直線相關(guān)。Western Blotting分析發(fā)現(xiàn)HBO治療組Wnt-3蛋白于HIBD后3 d、5 d與7 d達較高水平,β-catenin蛋白于HIBD后5d、7 d達較高水平,nestin總蛋白分別于7 d達較高水平,β-catenin核蛋白于HIBD后5 d達較高水平,均顯著高于對照組(P＜0.05);HIBD后14 d,各蛋白水平開始下降。 結(jié)論:高壓氧治療促進內(nèi)源性NSCs增殖的機制與Wnt信號途徑中Wnt-3蛋白表達的增加及β-catenin蛋白的活化相關(guān)。 綜上所述,本研究結(jié)論如下: 1.首次發(fā)現(xiàn)HBO治療可以促進HIBD新生大鼠內(nèi)源性NSCs的增殖、遷移并分化成為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞及少突膠質(zhì)細胞,從而修復腦損傷。 2.從HBO治療促進HIBD新生大鼠內(nèi)源性NSCs增殖的角度探討HBO治療HIBD的時間窗,并發(fā)現(xiàn)HBO治療的時間窗可以延長至HIBD后12 h,大大括寬了治療時間窗,為HIBD的治療贏得了時機。 3.從Wnt信號途徑探討HBO促進HIBD新生大鼠內(nèi)源性NSCs增殖的機制,并發(fā)現(xiàn)HBO促進內(nèi)源性NSCs的增殖與Wnt-3蛋白的增加、β-catenin蛋白的活化成直線相關(guān),為HBO治療HIBD提供了可靠的理論依據(jù),并為更好地促進內(nèi)源性NSCs的增殖治療HIBD指明了方向。
【圖文】：

果比較側(cè)腦室SVZ區(qū)是生后神經(jīng)干細胞增殖的主要生發(fā)區(qū)，且增殖的神經(jīng)干細胞可以遠距離遷移。圖1可見各組側(cè)腦室SVZ區(qū)背外側(cè)角BrdU于nestin+細胞密集成片分布。HIBD后6h，HBO治療組BrdU十nestin+細胞表達開始增加，顯著多于CON組(P<0.05)，與HIBD組差別不顯著(P>O.05);HIBD后24h，HBO組 BrdU+nestin+細胞數(shù)進一步增加，并多于CON組(尸 <0.01)，與HIBD組差別不顯著;HIBD后3d，HIBD組Bul礦nestin十細胞數(shù)達所觀察的時間點中的最高水平

eON組(尸 <0.05;表l一5)，Brdu+認+細胞分化比率(5.7士3，5，r=4.51)多于Hmo組(尸<0.05，見圖l一12，l一13，l一14)，HxBn組與eoN組 Brdu+04+細胞分化比率差別不顯著(鄉(xiāng)0.05，見表1一5;圖1一13，圖1一14)表1一5各組HIBD后28d損傷側(cè)大腦皮層神經(jīng)細胞分化比率(雙s，單位:%;n=10)組別例數(shù)神經(jīng)元細胞星形膠質(zhì)細胞少突膠質(zhì)細胞CON組HIBD組HBO組68.1士4.7*61.6士5.974.5土6.5*25.6土 7.6*6.3士3.434.8士9.216.8士5.8* 3.6封.1 8.7士3.5*nUn，

本文編號：2670283