發(fā)布時間：2020-05-05 16:32

【摘要】： 臨床上多種腎臟疾病不論其最初的發(fā)病因素如何，若慢性進展，則腎間質(zhì)纖維化(renal interstitial fibrosis，RIF)是它們的共同通路，最終會發(fā)展為終末期腎臟疾病(end stage renal disease，ESRD)。目前已經(jīng)明確轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是一種最重要的促腎臟纖維化因子，既可以活化腎間質(zhì)成纖維細胞，也可以使腎小管上皮細胞發(fā)生表型改變，使它們轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂屑〖毎硇偷募〕衫w維細胞，進而導致細胞周期失衡而無限制增生，并表達大量細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)，這是腎小管間質(zhì)損傷發(fā)生、發(fā)展至RIF的重要機制之一，因此尋找RIF過程中的負調(diào)控因子，進行早期干預，減輕或阻止腎小管間質(zhì)損傷從而減緩腎臟病慢性進展已經(jīng)成為腎臟病領(lǐng)域研究的熱門話題。 研究表明多種RIF過程中的負調(diào)控因子如肝細胞生長因子(hepatocytegrowth factor，HGF)等可以通過抑制TGF-β1而發(fā)揮抗纖維化作用。黃文彥等以單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction，UUO)方法建立RIF大鼠模型，檢測腎組織的基因表達譜時發(fā)現(xiàn)抗增殖蛋白(Prohibitin，PHB)基因明顯下調(diào)并推測其為介導RIF的重要基因之一。已知PHB基因是一種近年來發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制基因，它所編碼的PHB蛋白結(jié)構(gòu)保守，在細胞代謝、生長、衰老以及凋亡等諸多方面發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。但關(guān)于PHB在正常以及病變腎組織中的表達規(guī)律，以及關(guān)于PHB是否可以影響TGF-β1所誘導的腎臟成纖維細胞生物學行為變化及其分子機制，國內(nèi)外均未見報道。為此我們進行了以下三部分的研究，以初步探討PHB在腎小管間質(zhì)損傷的作用地位。 第一部分抗增殖蛋白在兒童腎小管間質(zhì)中的表達及意義 目的：觀察不同程度腎小管間質(zhì)損傷的患兒腎活檢組織中抗增殖蛋白(Prohibitin，PHB)的表達以及分布規(guī)律，探討PHB表達與腎小管間質(zhì)損傷之間的關(guān)系。對象與方法：選取不同病因和類型的原發(fā)性腎小球腎炎患兒腎活檢標本48例，其中病理類型為微小病變(MCNS)9例，系膜增生性腎炎(MsPGN)12例，局灶節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)5例，膜性腎病(MN)4例，IgA腎病(IgAN)18例，并以9例正常的腎組織標本作為對照。根據(jù)常規(guī)染色光鏡下腎小管間質(zhì)的病變分組，分級結(jié)果為：0級22例，1級13例，2級12例，3級10例。以免疫組織化學方法分別檢測各組標本PHB和α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的表達，并將PHB陽性表達指數(shù)與α-SMA陽性表達指數(shù)、腎小管間質(zhì)損傷程度、患兒腎小球濾過率(glomerular filtration rate，GFR)及尿乙酰-β-D葡萄糖苷酶(urinary N-acetyl-β-D-glucosamccharase，NAG)水平進行比較。 結(jié)果：正常腎組織中PHB蛋白質(zhì)陽性表達，程度由髓質(zhì)向皮質(zhì)逐步減弱，主要表達于腎小管上皮細胞及部分間質(zhì)細胞，而血管陰性；在腎小球系膜細胞弱陽性，腎小球上皮細胞、內(nèi)皮細胞未見表達。隨著腎小管間質(zhì)損傷程度的加重，上述細胞PHB的表達逐漸減弱，表達范圍也發(fā)生了一定的變化，損傷嚴重的腎小管上皮細胞和增生明顯的間質(zhì)細胞幾乎不表達PHB，腎小球系膜細胞亦陰性。不同分級腎小管間質(zhì)PHB蛋白質(zhì)陽性表達指數(shù)兩兩比較有顯著性差異(F=82.6，P＜0.01)。α-SMA蛋白在損傷腎間質(zhì)區(qū)域表達增強，在管腔破壞和萎縮的腎小管上皮細胞明顯表達。不同分級腎小管間質(zhì)α-SMA蛋白質(zhì)陽性表達指數(shù)兩兩比較有顯著性差異(F=90.5，P＜0.01)。根據(jù)線性回歸分析，腎小管間質(zhì)中PHB、α-SMA表達量之間負相關(guān)(r=-0.756，P＜0.01)，在損傷的腎小管間質(zhì)中，PHB與忠兒尿NAG水平之間顯著負相關(guān)(r=-0.802，P=0.003)，與患兒GFR水平無相關(guān)性(r=-0.447，P=0.232)。Spearman等級相關(guān)分析顯示，腎小管間質(zhì)損傷程度與PHB表達量顯著負相關(guān)(r=-0.802，P=0.003)，與α-SMA表達量顯著正相關(guān)(r=0.765，P=0.006)。 結(jié)論：人類正常腎組織存在著一定程度的PHB蛋白質(zhì)表達，在損傷腎小管間質(zhì)中PHB表達降低，PHB蛋白表達水平與腎小管間質(zhì)損傷程度負相關(guān)，與尿NAG水平顯著負相關(guān)，，提示PHB很可能是與腎小管間質(zhì)損傷有關(guān)的一種新的重要指標。 第二部分抗增殖蛋白抑制TGF-β1誘導的腎臟成纖維細胞增殖、表型改變和細胞外基質(zhì)表達 目的：觀察抗增殖蛋白(Prohibitin，PHB)對腎間質(zhì)成纖維細胞增殖、表型變化及表達細胞外基質(zhì)等生物學行為的影響并探討機制。 對象與方法：(1)觀察PHB在大鼠腎臟成纖維細胞(normal renal kidneyfibroblasts，NRK-49F)中亞細胞定位，以Western印跡和RT-PCR測定NRK-49F細胞受到TGF-β1作用后PHB表達的變化。(2)從NRK-49F細胞中擴增大鼠PHB基因全長的cDNA，構(gòu)建真核表達質(zhì)粒，測序成功后轉(zhuǎn)染NRK-49F細胞；觀察轉(zhuǎn)染PHB質(zhì)粒對NRK-49F細胞周期和細胞生長曲線的影響。(3)觀察轉(zhuǎn)染PHB質(zhì)粒對NRK-49F細胞表達α-SMA、細胞外基質(zhì)纖連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)、Ⅲ型膠原(collagen typeⅢ，ColⅢ)以及基質(zhì)金屬蛋白酶-1(matrixmetalloproteinase-1，MMP-1)蛋白質(zhì)和mRNA表達的影響。 結(jié)果：(1)激光共聚焦顯微鏡下見PHB主要分布于NRK-49F的細胞質(zhì)，細胞核亦有比較弱的表達。加入TGF-β1后NRK-49F細胞中PHB蛋白和mRNA表達均明顯下調(diào)，并且呈現(xiàn)時間依賴關(guān)系和劑量依賴關(guān)系。(2)成功構(gòu)建PHB真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1(-)／PHB，重組質(zhì)粒經(jīng)測序所得887bp的目的片段與Genebank中的原序列(BC097304)100％符合。Western印跡結(jié)果顯示，對數(shù)生長期NRK-49F細胞有PHB蛋白基礎表達，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后PHB表達升高約2.54倍(與空白對照組相比，P＜0.01)，而轉(zhuǎn)入空載體的細胞PHB的表達與未轉(zhuǎn)染的細胞比較無明顯變化(P＞0.05)，提示轉(zhuǎn)染成功。(3)TGF-β1可以明顯刺激NRK-49F細胞增殖，使更多的細胞脫離G0／G1期而進入S期和G2／M期(與空白對照組相比，P＜0.01)，轉(zhuǎn)染PHB質(zhì)�？梢悦黠@抑制TGF-β1誘導的增殖，使更多的細胞維持于G0／G1期(與TGF-β1組比較，P＜0.01)，而對未受到TGF-β1的細胞生長則無影響(與空白對照組相比，P＞0.05)。TGF-β1明顯刺激NRK-49F細胞生長，轉(zhuǎn)染PHB質(zhì)�？梢悦黠@抑制TGF-β1誘導的細胞增殖，24-48h之間抑制最明顯，24h時增殖抑制率27％，48h時增殖抑制率達48％，72h時增殖抑制率仍有35％，而對未受到TGF-β1的NRK-49F細胞生長幾乎無影響(與空白對照組相比，P＞0.05)。(4)空白組NRK-49F細胞不表達α-SMA蛋白和mRNA，TGF-β1刺激NRK-49F細胞表達α-SMA，并呈現(xiàn)時間和劑量依賴關(guān)系，轉(zhuǎn)染PHB基因可明顯抑制TGF-β1所誘導的α-SMA蛋白和mRNA表達(與TGF-β1組比較，P＜0.01)，而對細胞中α-SMA的基礎表達無影響(與空白對照組相比，P＞0.05)。TGF-β1刺激NRK-49F細胞后FN、ColⅢ和MMP-1 mRNA表達上調(diào)，分別為對照組的1.80倍、2.04倍和1.77倍；預先轉(zhuǎn)染PHB基因可以抑制TGF-β1誘導的FN和ColⅢmRNA表達上調(diào)，抑制率分別為44％和46％(與TGF-β1組比較，Ps＜0.01)，但對MMP-1mRNA表達無影響(與TGF-β1組比較，P＞0.05)。TGF-β1刺激NRK-49F細胞中FN、ColⅢ、MMP-1和E2F1蛋白表達上調(diào)，分別為對照組1.68倍、2.14倍、1.87倍和1.64倍；預先轉(zhuǎn)染PHB基因可以抑制TGF-β1誘導的FN、ColⅢ和E2F1蛋白質(zhì)表達上調(diào)，抑制率為30％、47％和44％(與TGF-β1組比較，P＜0.01)，但對MMP-1蛋白表達無影響(與TGF-β1組比較，P＞0.05)。 結(jié)論：NRK-49F細胞中有內(nèi)源性PHB表達，主要分布于細胞質(zhì)，細胞核亦有較弱表達；TGF-β1可以使NRK-49F中PHB表達下調(diào)；外源性PHB顯著抑制TGF-β1所誘導的成纖維細胞增殖、表型改變和表達細胞外基質(zhì)，提示PHB可能成為防治RIF的新靶點。 第三部分抗增殖蛋白通過抑制Smad3核轉(zhuǎn)位而拮抗TGF-β1對腎臟成纖維細胞的誘導 目的：探討抗增殖蛋白(Prohibitin，PHB)拮抗TGF-β1對腎臟成纖維細胞的誘導的分子生物學機制。 對象與方法：NRK-49F細胞生長至80％融合時轉(zhuǎn)染或不轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(-)／PHB質(zhì)粒，12h后換用無血清DMEM培養(yǎng)基，饑餓24h再加入或不加入1ng／ml TGF-β1，繼續(xù)孵育30min或48h，收獲細胞。以Western印跡方法檢測細胞總蛋白中Smad7和磷酸化Smad3的表達，以免疫共沉淀檢測細胞總蛋白中與Smad2／3結(jié)合的Smad4的量；分別抽提細胞漿與細胞核，以Western印跡方法檢測細胞核中磷酸化Smad3的表達量。 結(jié)果：(1)TGF-β1處理后NRK-49F細胞中磷酸化Smad3的表達量明顯增多(與空白對照組相比，P＜0.01)，轉(zhuǎn)染PHB質(zhì)粒對TGF-β1誘導的Smad3磷酸化無影響(與TGF-β1組比較，P＞0.05)；TGF-β1處理以及轉(zhuǎn)染PHB質(zhì)粒對NRK-49F細胞中Smad7表達水平無影響(與空白對照組相比，Ps＞0.05)。(2)免疫共沉淀檢測發(fā)現(xiàn)TGF-β1處理后細胞中與Smad2／3結(jié)合的Smad4表達量增多(與空白對照組相比，P＜0.01)，轉(zhuǎn)染PHB質(zhì)粒對TGF-β1誘導的Smad4和Smad2／3結(jié)合無影響(與TGF-β1組比較，P＞0.05)。(3)TGF-β1處理后NRK-49F細胞中核蛋白磷酸化Smad3的表達量明顯增多(與空白對照組相比，P＜0.01)，轉(zhuǎn)染PHB質(zhì)�？梢越档秃说鞍字辛姿峄疭mad3的表達量(與TGF-β1組比較，P＜0.01)。 結(jié)論：PHB對TGF-β1誘導的Smad3磷酸化、Smad7表達量以及與Smad3結(jié)合的Smad4的量均無影響，但是能夠抑制TGF-β1誘導的Smad3入核，提示PHB很可能是通過抑制活化的Smad3發(fā)生核轉(zhuǎn)位而拮抗TGF-β1對腎臟成纖維細胞的誘導。 總結(jié) 1、首次發(fā)現(xiàn)人腎組織表達PHB蛋白，主要分布于一些間充質(zhì)來源細胞如腎小管上皮細胞和腎間質(zhì)細胞，PHB蛋白表達水平與腎小管間質(zhì)損傷程度反向相關(guān)； 2、NRK-49F細胞有內(nèi)源性PHB表達，主要分布于細胞質(zhì)中，細胞核里亦有較弱表達； 3、受TGF-β1作用后NRK-49F細胞中PHB蛋白和mRNA表達均下調(diào)，外源性PHB抑制TGF-β1誘導的NRK-49F增殖，使細胞周期停滯于G0／G1期，可以抑制TGF-β1誘導的NRK-49F表型變化并減少分泌細胞外基質(zhì)表達，但不影響MMP1的表達； 4、PHB可以抑制活化的Smad3發(fā)生核轉(zhuǎn)位，這很可能是PHB拮抗TGF-β1對腎臟成纖維細胞的誘導活化的關(guān)鍵所在，因此PHB有可能成為減緩腎臟疾病慢性進展的一種新的分子靶標。
【圖文】：

表達明顯降低，分化時PHB表達明顯升高，基因轉(zhuǎn)染過量表達PHB可抑制人白血病細胞、前列腺癌細胞等進入細胞增殖周期，基因干擾PHB表達則可促進上述細胞增殖【35一371。圖1顯示目前所知道的有關(guān)PHB的信號通路，還存在許多問號等待我們?nèi)ソ獯�，還存在許多問題需要我們?nèi)ヲ炞C。鑒于PHB具有明顯的抗細胞增殖作用，同時基因芯片檢測結(jié)果也發(fā)現(xiàn)纖維化大鼠腎組織PHB基因表達明顯下調(diào)，提示這種下調(diào)很有可能參與了租F的發(fā)生發(fā)展，然而PHB在正常以及病變腎組織中的分布、表達規(guī)律以及是否與具有腎臟保護作用，尚未檢索到國內(nèi)外有相關(guān)報道。為了研究PHB基因及其表達產(chǎn)物在腎臟纖維化過程中的表達以及變化規(guī)律，探討PHB在RIF發(fā)生發(fā)展中的意義

圖2:TGF一印使NRK一49F細胞中PHB蛋白和mRNA表達下調(diào)。A:以相同劑量(0.2nmol/L)的各種生長因子刺激細胞48h;B:PHB蛋白表達的劑量依賴曲線，作用時間為48h;c:PHB蛋白表達的時間依賴曲線，TGF一pl劑量為1ng八nl;D:PHBmRNA表達的劑量依賴曲線，作用時間為48h。*，與對照組比較，尸<0.01，實驗重復3次。
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R726.9

【引證文獻】

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1 彭單單;覃遠漢;邵明斌;周添標;徐會凌;程會元;雷鳳英;周春;黃韋芳;;Prohibitin1和Prohibitin2在缺氧性腎小管上皮細胞損傷中的表達及作用[J];實用兒科臨床雜志;2012年05期

本文編號：2650441