【摘要】：背景與目的 新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic ischemic encephalopathy,HIE)是由于圍產(chǎn)期缺氧窒息致新生兒缺氧缺血性腦損傷(hypoxic ischemic brain damage,HIBD),臨床上出現(xiàn)腦病表現(xiàn),部分病例可留有不同程度神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥,在圍產(chǎn)期神經(jīng)系統(tǒng)疾病中占重要地位,是引起兒童期腦癱的主要原因。近年研究發(fā)現(xiàn)ATP敏感性鉀離子通道(ATP-sensitive K~+ channels,K_(ATP)通道)開放對多種組織細胞缺氧缺血損傷有保護作用,該通道是電壓非依賴性配體門控通道,在缺氧缺血等病理狀態(tài)下被激活開放,使大量K~+外流,細胞膜超極化,從而使Na~+、Ca~(2+)內(nèi)流減少,避免或減輕鈣超載、減少能耗、減輕興奮性氨基酸及氧自由基釋放,保護細胞。克羅卡林是一種針對線粒體K_(ATP)通道特異性的鉀通道開放劑(K_(ATP) channel opener, KCO),許多研究證實克羅卡林預(yù)處理能對抗缺氧缺血性腦損傷,具有神經(jīng)保護作用,然而其具體保護機制尚不明確。本文以宮內(nèi)窒息致HIBD新生大鼠為研究對象,觀察不同腦區(qū)(皮質(zhì)、海馬、小腦、丘腦、腦干)K_(ATP)通道亞基蛋白(Kir6.1、Kir6.2、SUR1、SUR2B)基因表達情況,以及加用克羅卡林預(yù)處理后對不同腦區(qū)的保護作用不同,以期進一步闡明KCOs對腦保護作用的分子機制。該研究結(jié)果為深入認識K_(ATP)通道亞基蛋白在腦組織不同區(qū)域的表達情況提供依據(jù),為開發(fā)特異性更高的K_(ATP)通道開放劑治療新生兒HIE提供理論基礎(chǔ)。 材料與方法 采用剛出生SD新生大鼠250只,分為五組,隨機分為正常對照組(Control組)、缺氧缺血組(HI組)、克羅卡林組(Cro組)、溶劑對照組(NaOH組)及克羅卡林+格列苯脲(Cro+Gli)組,每組50只。HI組、Cro組、NaOH組及Cro+Gli組均制作成HIBD模型。分別在窒息后0h、12h、24h,共給藥三次,克羅卡林每次按100ug/kg腹腔內(nèi)注射,克羅卡林+格列苯脲組在上述相同時間點用克羅卡林后立即腹腔注射通道抑制劑格列本脲每次300ug / kg,抑制通道開放。NaOH組于同樣時間點給予腹腔注射0.1M NaOH,體積同Cro組。 對各組動物進行神經(jīng)行為學(xué)評分,采用HE染色觀察病理改變和進行顯微損傷評分,TTC染色測量腦梗死面積,RT-PCR方法檢測K_(ATP)通道亞基蛋白(Kir6.1、Kir6.2、SUR1、SUR2B)基因表達情況。實驗結(jié)果用EXCEL2003和SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析處理。結(jié)果以均數(shù)±標準差((x|-)±s)表示,采用重復(fù)測量分析(repeated measures)、方差分析(ANOVA)、LSD、SNK和Dunnett T3進行組間均數(shù)比較,P0.05為差異有顯著性。 結(jié)果 1.神經(jīng)行為觀察及評分:正常對照組動物未見明顯的神經(jīng)功能缺失,窒息組(HI組)、溶劑對照組(NaOH組)缺血缺氧后癥狀較重,出現(xiàn)煩躁不安,驚跳,呼吸加深加快,隨著缺氧時間延長,出現(xiàn)嗜睡,活動減少;重則抽搐、昏迷�？肆_卡林組神經(jīng)行為學(xué)評分較HI組及NaOH組低,克羅卡林+格列苯脲組神經(jīng)行為學(xué)評分較克羅卡林組高(P0.05)。窒息組與溶劑組差異無統(tǒng)計學(xué)意義,P0.05,窒息組、溶劑對照組克羅卡林+格列苯脲組克羅卡林組正常對照組,P0.01,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。 2.HE染色病理變化和顯微損傷評分:從常規(guī)HE染色的病理切片觀察結(jié)果來看,正常對照組光鏡下腦組織結(jié)構(gòu)、層次清晰,細胞數(shù)目較多,排列規(guī)則,細胞輪廓及核仁清楚可見,細胞及間質(zhì)無水腫;HI組及NaOH組可見大腦皮質(zhì)神經(jīng)元正常排列結(jié)構(gòu)消失,間質(zhì)水腫,神經(jīng)細胞腫脹,核結(jié)構(gòu)不清、固縮,繼而變性、壞死,有空泡變,可見細胞凋亡,神經(jīng)元數(shù)目明顯減少;克羅卡林組腦組織細胞亦有不同程度的水腫、變性及壞死,神經(jīng)元數(shù)目略微減少,多數(shù)細胞形態(tài)基本保持完整,細胞排列相對整齊,壞死程度較HI組及NaOH組減輕�？肆_卡林+格列苯脲組腦組織形態(tài)特點較克羅卡林組重。HE顯微損傷評分結(jié)果:每個腦區(qū)各組通過兩兩比較,窒息組、溶劑對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義,P0.05,窒息組、溶劑對照組克羅卡林+格列苯脲組克羅卡林組正常對照組,P0.05或者P0.01,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。每個腦區(qū)的窒息組進行對比,海馬、皮質(zhì)小腦、丘腦、腦干,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。 3.通過TTC染色測量腦梗死面積提示:正常組整個腦組織呈紅色,窒息組及溶劑組腦組織梗死區(qū)較大,克羅卡林組腦組織梗死區(qū)較小,克羅卡林+格列苯脲組腦組織梗死區(qū)較克羅卡林組大。通過兩兩比較,窒息組、溶劑對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義,P0.05,窒息組、溶劑對照組克羅卡林+格列苯脲組克羅卡林組正常對照組,P0.01,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。 4.RT-PCR方法檢測K_(ATP)通道亞單位基因在不同腦區(qū)表達情況:不同腦區(qū)Kir6.1、Kir6.2各組進行比較,窒息組、溶劑對照組與克羅卡林+格列苯脲組、克羅卡林組、正常對照組對比,P0.01,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。窒息組與溶劑對照組對比,P0.05,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。皮質(zhì)區(qū)Kir6.2kir6.1,海馬區(qū)Kir6.2kir6.1,P0.05,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。利用各腦區(qū)Kir6.2(克羅卡林組與對照組)比較,皮質(zhì)區(qū)克羅卡林與對照組表達量相近,P=0.44,無統(tǒng)計學(xué)意義,而海馬區(qū)P=0.29,也無統(tǒng)計學(xué)意義。小腦、丘腦、腦干P值均小于0.05,有統(tǒng)計學(xué)意義。不同腦區(qū)的SUR1、SUR2B各組進行比較,窒息組、溶劑對照組與克羅卡林+格列苯脲組、克羅卡林組、正常對照組對比, P0.01,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。窒息組與溶劑對照組對比,P0.05,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。皮質(zhì)區(qū)SUR2B SUR1,海馬區(qū)SUR1 SUR2B,P0.05,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論 1.本實驗顯示給予K_(ATP)通道開放劑克羅卡林能顯著改善HIBD新生大鼠神經(jīng)功能缺損程度,減少腦組織細胞的水腫、變性及壞死程度,減少腦缺血再灌注后梗死面積。提示K_(ATP)通道開放劑對腦缺血再灌注損傷具有重要的保護作用。 2.在新生鼠缺血缺氧性腦損傷后,通過腦損傷評分,海馬及皮質(zhì)評分最高,提示海馬和皮質(zhì)損傷程度最高。 3.同一腦組織不同部位K_(ATP)通道組成不同,而克羅卡林對損傷最嚴重的皮質(zhì)區(qū)和海馬區(qū)有較好的保護作用,格列本脲能抑制克羅卡林的腦保護作用。
【圖文】：

附圖1：制作宮內(nèi)窒息模型及正常新生鼠腦大體觀附圖2：顯微神經(jīng)細胞HE×400 倍：圖2-1 正常組新生鼠皮質(zhì)HE×400 圖2-2 正常組新生鼠海馬HE×400圖2-3 窒息組新生鼠皮質(zhì)HE×400 圖2-4 窒息組新生鼠海馬HE×400

附圖1：制作宮內(nèi)窒息模型及正常新生鼠腦大體觀附圖2：顯微神經(jīng)細胞HE×400 倍：圖2-1 正常組新生鼠皮質(zhì)HE×400 圖2-2 正常組新生鼠海馬HE×400圖2-3 窒息組新生鼠皮質(zhì)HE×400 圖2-4 窒息組新生鼠海馬HE×400
【學(xué)位授予單位】：汕頭大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R722.1

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 黃廣;林霓陽;肖育;;K_(ATP)開放劑克羅卡林對新生鼠缺氧缺血性腦損傷細胞凋亡的影響[J];中國婦幼保健;2006年07期

2 黃浩,李曉明,高天明;鉀通道阻斷劑TEA對大鼠全腦缺血后海馬神經(jīng)元損傷的保護作用[J];中國神經(jīng)科學(xué)雜志;2001年02期

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本文編號：2629529