【摘要】：α-地中海貧血、β-地中海貧血和DMD都是嚴(yán)重危害人類生命健康的最常見單基因遺傳病,目前,臨床上只能對(duì)常見的點(diǎn)突變和缺失重復(fù)突變進(jìn)行檢測(cè),而由于點(diǎn)突變致病的患兒或攜帶者往往會(huì)漏診或得不到基因診斷。如DMD基因,由于其基因序列龐大并且沒有點(diǎn)突變熱區(qū),在臨床上只能對(duì)缺失和重復(fù)突變進(jìn)行檢測(cè),而點(diǎn)突變致病的病人失去基因診斷的機(jī)會(huì),也意味著他們家族不能進(jìn)行DMD的產(chǎn)前診斷;β-地中海貧血突變?nèi)绻皇浅Ｒ姷耐蛔?可能導(dǎo)致中重度患兒的出生。測(cè)序是點(diǎn)突變檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)但是繁瑣并且成本高、工作量大。因此急需尋求一種簡(jiǎn)單、靈敏度高的點(diǎn)突變檢測(cè)方法,很多研究致力于通過先對(duì)該基因進(jìn)行點(diǎn)突變篩查,篩查出懷疑點(diǎn)突變的序列后再進(jìn)行測(cè)序,從而大大減輕成本以及工作量。最近不少文獻(xiàn)認(rèn)為HRM分析方法是一種很好的新點(diǎn)突變檢測(cè)方法。 第一部分建立HRM分析檢測(cè)單基因遺傳病點(diǎn)突變 目的 以β-珠蛋白、DMD和α-珠蛋白的基因?yàn)檠芯繉?duì)象,建立應(yīng)用HRM分析方法檢測(cè)單基因遺傳病點(diǎn)突變的方法,并探討該方法是否適用于基因純合突變的檢測(cè)。 方法 1.采用LightScanner96和LightScanner32 HRM分析儀進(jìn)行檢測(cè),結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳對(duì)引物、引物濃度、引物最佳退火溫度、鎂離子濃度、模板起始量及染料加入的時(shí)間進(jìn)行摸索。 2.對(duì)76個(gè)包含正常及點(diǎn)突變的β-珠蛋白的標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè),其中有12個(gè)是常見突變基因型的純合突變標(biāo)本,對(duì)這些純合的突變標(biāo)本進(jìn)行兩種方法檢測(cè),首先進(jìn)行常規(guī)的點(diǎn)突變篩查掃描然后加入等比例的野生型標(biāo)本混合后再進(jìn)行掃描檢測(cè)。并且將該方法對(duì)8個(gè)DMD,其中一個(gè)為DMD第四外顯子已知點(diǎn)突變進(jìn)行檢測(cè)。 3.用突變篩查掃描法及不對(duì)稱PCR結(jié)合非標(biāo)記封閉探針法對(duì)24個(gè)含正常和α-地貧的CS、QS、WS三種點(diǎn)突變標(biāo)本檢測(cè)。 4.對(duì)懷疑存在點(diǎn)突變的標(biāo)本用ABI 3100基因測(cè)序儀對(duì)β-珠蛋白基因進(jìn)行測(cè)序。 結(jié)果 用HRM方法檢測(cè)基因點(diǎn)突變時(shí),需要把模板起始濃度稀釋為同一濃度;引物最佳退火溫度比加入染料前的溫度要高。該方法可對(duì)β-珠蛋白點(diǎn)突變進(jìn)行掃描篩查,結(jié)果與RDB方法或測(cè)序方法一致;對(duì)于一個(gè)DMD男性患者第四外顯子點(diǎn)突變的標(biāo)本和十二個(gè)CD41/42、IVS-ΙΙ-654、TATAbos -28、CD17的純合突變標(biāo)本均可以通過直接掃描及野生型標(biāo)本混合后進(jìn)行掃描兩種方法進(jìn)行區(qū)分。而不對(duì)稱PCR結(jié)合非標(biāo)記封閉探針法對(duì)α-地貧的CS、QS、WS三種點(diǎn)突變標(biāo)本檢測(cè)未能成功,需進(jìn)一步優(yōu)化。 結(jié)論 本研究建立了應(yīng)用HRM分析方法對(duì)單基因點(diǎn)突變遺傳病檢測(cè)的平臺(tái),可快速、可靠地對(duì)雜合和純合點(diǎn)突變的基因進(jìn)行檢測(cè)。 第二部分β-地中海貧血的臨床檢測(cè) 第一章HbA2篩查β-地中海貧血的作用 目的 評(píng)估HbA2升高(≥3.5%)篩查β?地中海貧血的作用。 方法 應(yīng)用血常規(guī)自動(dòng)分析儀對(duì)360名婦女進(jìn)行血常規(guī)檢測(cè),高效液相色譜法血紅蛋白電泳進(jìn)行HbA2水平檢測(cè)。第一組為HbA2水平≥3.5%的65名孕婦,85名為非孕婦女,均進(jìn)行RDB或β-珠蛋白基因測(cè)序檢測(cè),第二組為HbA2水平 3.5%的96名孕婦,114名非孕婦女,如果MCH29pg, MCV90fl的不作基因檢測(cè),HbA2值在3.0%-3.5%進(jìn)行β-珠蛋白基因測(cè)序,其余的進(jìn)行RDB方法檢測(cè)。利用t檢驗(yàn)對(duì)HbA2的值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。 結(jié)果 1.第一組中(n= 150名,20-40歲),其中65名為孕婦,85名為非孕婦女,她們的HbA2水平≥3.5%,RDB方法檢測(cè)顯示147名為中國(guó)常見的β-地中海貧血突變,其中三名用RDB檢測(cè)未見異常,經(jīng)測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)其中兩例為RDB不能檢測(cè)的Hb Kaohsiung雜合點(diǎn)突變即HBB:c.341T A雜合點(diǎn)突變,第三例為-90 (CT)雜合點(diǎn)突變即HBB:c.-140CT雜合點(diǎn)突變。 2.第二組中(n= 210, 20-40歲),其中96名孕婦,114名非孕婦女,RDB方法檢測(cè)顯示均未發(fā)現(xiàn)β-地中海貧血基因突變,并且用測(cè)序方法檢測(cè)HbA2范圍在3.0%-3.5%的標(biāo)本,也未發(fā)現(xiàn)存在β-地中海貧血基因突變。 3.沒有地中海貧血攜帶的孕婦跟非孕婦比較,孕婦的HbA2水平輕微升高(P0.05),但她們HbA2的水平均未超過或者達(dá)到3.5%。 結(jié)論 妊娠雖然可使HbA2的水平稍微升高,但是并未影響到HbA2對(duì)β-地中海貧血攜帶者的篩查作用,不論在孕婦還是非孕婦中,HbA2均有很好的篩查β-地中海貧血攜帶者的價(jià)值。 第二章應(yīng)用HRM分析檢測(cè)β?地中海貧血基因點(diǎn)突變 目的 應(yīng)用上述建立的HRM分析方法對(duì)未知基因型的標(biāo)本進(jìn)行β-珠蛋白基因檢測(cè),探討其臨床應(yīng)用的可行性。 方法 1.應(yīng)用上述第一部分優(yōu)化的條件方法對(duì)未知基因型的標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。 2.選取60個(gè)標(biāo)本,其中包含5個(gè)血液學(xué)和HbA2確認(rèn)的β?地中海貧血攜帶但是RDB方法沒發(fā)現(xiàn)異常的標(biāo)本,先進(jìn)行HRM分析檢測(cè)再進(jìn)行RDB或β-珠蛋白序列測(cè)序檢測(cè)進(jìn)行結(jié)果比較。 3.進(jìn)行HRM分析檢測(cè)時(shí)加入中國(guó)最常見的β?地中海貧血雜合突變基因型標(biāo)本作陽(yáng)性對(duì)照及正常野生型標(biāo)本作為陰性對(duì)照。 結(jié)果 P1+P2引物的反應(yīng)產(chǎn)物中,有一個(gè)標(biāo)本通過與RDB和測(cè)序檢測(cè)結(jié)果相比較發(fā)現(xiàn)為假陽(yáng)性。其它檢測(cè)出存在突變的標(biāo)本的曲線均與陽(yáng)性對(duì)照分型一致。5個(gè)外送的血液學(xué)提示β?地中海貧血攜帶的標(biāo)本中均在掃描時(shí)發(fā)現(xiàn)有異常曲線,經(jīng)測(cè)序檢測(cè)確認(rèn)為一個(gè)Hb G-Coushatta即HBB:c.68AC、一個(gè)Cd37 (TGGTAG)即HBB:c.113GA、一個(gè)Hb L'Aquila即HBB:c.319CG和兩個(gè)Hb New York即HBB:c.341TA雜合突變,其余結(jié)果與RDB方法或測(cè)序方法確定的基因型一致。 結(jié)論 HRM分析方法可對(duì)臨床β?地中海貧血突變進(jìn)行快速的分型和突變掃描檢測(cè)。
【圖文】：

利用兩對(duì)引物擴(kuò)增時(shí)產(chǎn)物的HRM分析結(jié)果圖

隨機(jī)抽取上述四個(gè)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊
【學(xué)位授予單位】：廣州醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R725.5

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本文編號(hào)：2627821