發(fā)布時(shí)間：2020-04-14 13:15

【摘要】： 背景和目的 先天性腎積水是小兒外科常見畸形,約占新生兒的1%-2%,是兒童終末型腎功能衰竭的重要原因。腎盂輸尿管連接部梗阻(ureteropelvic junction obstruction, UPJO)是導(dǎo)致新生兒非生理性腎積水最常見的原因,約占兒童腎積水的10%,而且梗阻大部分為先天性不完全梗阻。尿液濃縮能力下降是積水腎臟早期的功能變化。積水腎臟尿液濃縮和排泄功能變化的分子生物學(xué)機(jī)制目前仍不完全清楚。Agre和其同事在90年代發(fā)現(xiàn)水通道蛋白(Aquaporins, AQPs)后,腎臟濃縮功能機(jī)理研究在分子水平上獲得了重大進(jìn)展。 目前發(fā)現(xiàn)的13種水通道蛋白中分布于腎臟的有7種,主要分布在腎小球、近端小管、集合管和髓袢降支。其中現(xiàn)已明確AQP1-4是腎臟重吸收水濃縮尿液,從而維持機(jī)體水平衡的主要分子基礎(chǔ)。為進(jìn)一步揭示生理狀態(tài)體液代謝平衡和病理狀態(tài)下體液紊亂機(jī)制和尋找治療及預(yù)防措施提供了較大幫助。研究表明,AQP1主要表達(dá)在腎單位的近端小管和髓袢下降支細(xì)段上皮細(xì)胞的頂質(zhì)膜,而基側(cè)膜則表達(dá)較少。AQP2是腎集合管柱狀上皮細(xì)胞內(nèi)最重要的水通道蛋白,是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的唯一在細(xì)胞內(nèi)分布受激素調(diào)控的水通道蛋白。AQP3位于集合管主細(xì)胞的基底膜和兩側(cè)膜上,在連接管也有大量的AQP3分布,AQP3既受加壓素的調(diào)節(jié),也受醛固酮調(diào)節(jié)。AQP4主要位于大鼠腎臟內(nèi)髓集合管基底側(cè)質(zhì)膜上,可能參與集合管水分重吸收和尿液濃縮,但在近端小管S3節(jié)段基底側(cè)質(zhì)膜上也有表達(dá)。 動物研究顯示積水腎臟尿液濃縮及稀釋功能的變化與AQPs的表達(dá)異常有關(guān)。雙側(cè)輸尿管梗阻24h顯著影響腎臟AQP1在近端小管和AQP2-4在集合管的表達(dá),使其表達(dá)明顯下調(diào)。該變化可能對雙側(cè)輸尿管梗阻后水分重吸收障礙并引發(fā)低滲性多尿的病理生理過程起重要作用。單側(cè)輸尿管梗阻24h也可造成腎臟AQP1-4表達(dá)下調(diào)。AQPs的表達(dá)下降可能對單側(cè)梗阻后水分重吸收障礙并引發(fā)低滲性多尿的病理生理過程起重要作用。上述研究結(jié)果均來自動物實(shí)驗(yàn)。目前,國內(nèi)外文獻(xiàn)對人類積水腎臟中AQP1-4的研究至今未見報(bào)道。對兒童積水腎臟中AQP1-4的研究無疑將有助于揭示小兒腎積水濃縮稀釋功能變化的機(jī)制。 有關(guān)AQP1-4 mRNA和蛋白表達(dá)與UPJO患兒積水腎臟超聲形態(tài)、排泄功能、病理組織學(xué)改變和腎小球?yàn)V過率(glomerular filtration rate, GFR)之間關(guān)系尚不清楚,而了解這些是臨床醫(yī)生面臨的重要課題。因此本研究目的為：①觀察人類先天性積水腎臟中AQP1-4 mRNA和蛋白的表達(dá)與B超分類和靜脈腎盂造影分類不同積水程度之間的關(guān)系；②觀察不同病理組織學(xué)改變的小兒先天性積水腎臟組織中AQP1-4 mRNA和蛋白的表達(dá)情況；③觀察先天性積水腎臟中AQP1-4蛋白的表達(dá)與腎實(shí)質(zhì)厚度變化和腎小球?yàn)V過率變化之間的關(guān)系。 1.收集22例接受腎盂成形術(shù)和腎造瘺術(shù),經(jīng)手術(shù)后病理證實(shí)的先天性UPJO腎臟標(biāo)本(男15例,女7例,年齡58.9±54.3月)。病變部位均為單側(cè),其中右側(cè)15例,左側(cè)7例。正常腎臟組織8例(男5例,女3例,年齡58.0±37.7月)來自小兒外科行腎切除術(shù)的經(jīng)手術(shù)后病理證實(shí)的腎母細(xì)胞瘤癌旁的正常腎組織。 2.按照國際胎兒協(xié)會制定的根據(jù)腎實(shí)質(zhì)厚度和腎盂腎盞擴(kuò)張超聲表現(xiàn)的分級標(biāo)準(zhǔn)將上述患兒分為Ⅲ級腎積水(輕度腎積水組)和Ⅳ級腎積水(重度腎積水組)。其中Ⅲ級腎積水8例,Ⅳ級腎積水14例。 3.按照靜脈腎盂造影(Intravenous Pyelography, IVP)顯影時(shí)間的長短將上述患兒分為兩組。輕度腎積水組(10例；IVP 60min內(nèi)腎盂腎盞顯影)和重度腎積水組(12例；IVP 60min內(nèi)腎盂腎盞不顯影)。 4.利用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測所有積水腎臟和正常腎臟標(biāo)本中AQP 1-4在正常腎臟和積水腎臟中的表達(dá)與定位。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)分別檢測AQP1-4 mRNA在所有積水腎臟和正常腎臟標(biāo)本中的表達(dá)水平。蛋白免疫印跡法(Western Blot)分別檢測AQP1-4蛋白在所有積水腎臟和正常腎臟標(biāo)本中的表達(dá)水平。 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用SPSS 13.0 for windows統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；所有數(shù)值均近似正態(tài)分布,兩組均數(shù)之間的比較用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)(t-test),三組及三組以上均數(shù)的比較用單因素方差分析(ANOVA)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為P=0.05。 結(jié)果 1.免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示：AQP1陽性著色主要分布在腎近曲小管的上皮細(xì)胞和髓袢降支細(xì)段上皮細(xì)胞胞質(zhì),以及腎小球毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)。AQP2陽性著色主要分布在腎集合管主細(xì)胞胞膜和胞質(zhì)。AQP3陽性著色主要分布在腎集合管主細(xì)胞基底側(cè)膜。AQP4陽性著色主要分布在腎內(nèi)髓集合管主細(xì)胞基底側(cè)膜。與正常腎臟組織中AQP1-4的表達(dá)強(qiáng)度相比,積水程度越重的腎臟組織中AQPl-4的陽性表達(dá)強(qiáng)度越弱。 2.RT-PCR結(jié)果顯示B超分類腎積水的重度腎積水組中AQP1-4 mRNA的相對表達(dá)量明顯低于輕度腎積水組和正常腎臟組(AQP1：0.237±0.154 Vs.0.624±0.084 Vs.0.858±0.122；AQP2：0.283±0.124 Vs.0.583±0.112 Vs.0.976±0.134;AQP3：0.460±0.146 Vs.0.760±0.066 Vs.1.006±0.084；AQP4：0.196±0.124 Vs.0.439±0.076 Vs.0.739±0.201；P0.01)。RT-PCR結(jié)果顯示IVP分類腎積水的重度腎積水組中AQP1-4 mRNA的相對表達(dá)量明顯低于輕度腎積水組和正常腎臟組(AQP 1：0.194±0.118 Vs.0.598±0.092 Vs.0.858±0.122；AQP2：0.247±0.089 Vs.0.566±0.105 Vs.0.976±0.134；AQP3：0.426±0.126 Vs.0.741±0.074 Vs.1.006±0.084；AQP4：0.171±0.115 Vs.0.420±0.081 Vs.0.739±0.201;P0.01)。 3.Western Blot結(jié)果顯示B超分類腎積水的重度腎積水組中AQP1-4蛋白的相對表達(dá)量明顯低于輕度腎積水組和正常腎臟組(AQP1：0.349±0.096 Vs.0.705±0.059 Vs.0.895±0.040；AQP2：0.242±0.113 Vs.0.609±0.037 Vs.0.868±0.084；AQP3：0.195±0.133 Vs.0.575±0.050 Vs.0.806±0.076；AQP4：0.241±0.067 Vs.0.598±0.074 Vs.0.809±0.079；P0.01)。Western Blot結(jié)果顯示IVP分類腎積水的重度腎積水組中AQP1-4蛋白的相對表達(dá)量明顯低于輕度腎積水組和正常腎臟組(AQP 1：0.343±0.099 Vs.0.692±0.062 Vs.0.895±0.040；AQP2：0.217±0.126 Vs.0.567±0.069 Vs.0.868±0.084；AQP3：0.171±0.127 Vs.0.543±0.082 Vs.0.806±0.076；AQP4：0.225±0.063 Vs.0.537±0.078 Vs.0.809±0.079；P0.01)。 1.收集26例接受腎盂成形術(shù)和腎造瘺術(shù),經(jīng)手術(shù)后病理證實(shí)的先天性UPJO腎臟標(biāo)本(男17例,女9例,年齡55.9±49.5月)。病變部位均為單側(cè),其中右側(cè)15例,左側(cè)11例。正常腎臟組織10例(男6例,女4例,年齡63.7±36.8月)來自小兒外科行腎切除術(shù)的經(jīng)手術(shù)后病理證實(shí)的腎母細(xì)胞瘤癌旁的正常腎組織。 2.將上述患兒根據(jù)其積水腎臟的病理組織學(xué)變化將其分為病理學(xué)分級Ⅱ-Ⅲ級組,即輕度腎積水組(12例),和病理學(xué)分級Ⅳ-Ⅴ級組,即重度腎積水組(14例)。 3.利用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測所有積水腎臟和正常腎臟標(biāo)本中AQP1-4在正常腎臟和積水腎臟中的表達(dá)與定位。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)分別檢測AQP1-4 mRNA在所有積水腎臟和正常腎臟標(biāo)本中的表達(dá)水平。蛋白免疫印跡法(Western Blot)分別檢測AQP1-4蛋白在所有積水腎臟和正常腎臟標(biāo)本中的表達(dá)水平。 4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用SPSS 13.0 for windows統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；所有數(shù)值均近似正態(tài)分布,兩組均數(shù)之間的比較用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)(t-test),三組及三組以上均數(shù)的比較用單因素方差分析(ANOVA)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為P=0.05。 結(jié)果 1.免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示與第一部分中AQP1-4的免疫組化檢測結(jié)果保持一致。 2.RT-PCR結(jié)果顯示病理學(xué)分級Ⅳ-Ⅴ級組,即重度腎積水組中AQP1-4mRNA的相對表達(dá)量明顯低于輕度腎積水組和正常腎臟組(AQP1：0.154±0.12 Vs.0.618±0.10 Vs.0.858±0.12；AQP2：0.229±0.11 Vs.0.535±0.12 Vs.0.946±0.14；AQP3：0.402±0.15 Vs.0.7244±0.08 Vs.0.978±0.10;AQP4：0.169±0.11 Vs.0.423±0.08 Vs.0.756±0.18;P0.01)。 3.Western Blot結(jié)果顯示病理學(xué)分級Ⅳ-Ⅴ級組,即重度腎積水組中AQP1-4蛋白的相對表達(dá)量明顯低于輕度腎積水組和正常腎臟組(AQP1：0.335±0.096 Vs.0.697±0.057 Vs.0.878±0.051;AQP2：0.195±0.133 Vs.0.569±0.069 Vs.0.816±0.072；AQP3：0.229±0.104 Vs.0.553±0.089 Vs.0.797±0.081;AQP4：0.241±0.067 Vs.0.528±0.084 Vs.0.833±0.104；P0.01)。 材料與方法 1.收集10例接受腎盂成形術(shù)和腎造瘺術(shù),經(jīng)手術(shù)后病理證實(shí)的先天性UPJO腎臟標(biāo)本(男6例,女4例,年齡62.3±18.3月)。病變部位均為左側(cè)。正常腎臟組織6例(男4例,女2例,年齡62.7±17.1月)來自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院小兒外科行腎切除術(shù)的經(jīng)手術(shù)后病理證實(shí)的腎母細(xì)胞瘤癌旁的正常腎組織。 2.10例患兒均接受B超檢測來驗(yàn)證腎實(shí)質(zhì)厚度,同時(shí)接受核素99mTc-DTPA腎動態(tài)顯像對患側(cè)腎臟GFR進(jìn)行評估。手術(shù)過程中對腎積水程度進(jìn)行再次評估,重點(diǎn)觀察腎實(shí)質(zhì)厚度。 3.利用蛋白免疫印跡法(Western Blot)分別檢測AQP1-4蛋白在所有積水腎臟和正常腎臟標(biāo)本中的表達(dá)水平。 4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用SPSS 13.0 for windows統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；所有數(shù)值均近似正態(tài)分布,兩組均數(shù)之間的比較用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)(t-test)。積水腎臟中AQP1-4蛋白的相對表達(dá)量與99mTc-DTPA測定的GFR,以及積水腎臟腎實(shí)質(zhì)厚度之間進(jìn)行Pearson相關(guān)分析檢驗(yàn)是否具有相關(guān)性,r值為Pearson相關(guān)系數(shù)。雙側(cè)P0.05時(shí)認(rèn)為有顯著性差異。 結(jié)果 1.Western Blot結(jié)果顯示正常腎臟組織中AQP1-4蛋白相對表達(dá)量分別為0.744±0.21、0.844±0.19、0.82±0.20和0.82±0.14,先天性積水腎臟組織中AQP1-4的相對表達(dá)量分別為0.40±0.14、0.48±0.18、0.47±0.21和0.55±0.22。正常腎組織中AQP1-4蛋白相對表達(dá)均明顯高于腎積水組(P0.05)。 2.先天性腎積水患兒術(shù)前測量患側(cè)腎臟腎實(shí)質(zhì)厚度為1.8-8.5mm,平均為4.59±2.25mm。99mTc-DTPA測定患兒患側(cè)腎臟GFR為24.01-56.65ml/min,平均為39.93±11.52ml/min。對側(cè)腎臟GFR為84.08-118.09ml/min,平均為105.36±20.38ml/min�；紓�(cè)腎臟GFR較對側(cè)腎臟明顯下降(P0.05)。 3.積水腎臟中AQP1-4蛋白相對表達(dá)量與積水側(cè)腎臟腎實(shí)質(zhì)厚度之間的相關(guān)性分析結(jié)果顯示AQP1-4蛋白相對表達(dá)量與積水側(cè)腎臟腎實(shí)質(zhì)厚度之間的相關(guān)性系數(shù)r分別為0.754、0.724、0.726和0.716。P值分別為0.012、0.018、0.017和0.02,均0.05,說明積水腎臟中AQP1-4蛋白相對表達(dá)量與腎實(shí)質(zhì)厚度之間呈正相關(guān)。積水腎臟中AQP1-4蛋白相對表達(dá)量與積水側(cè)腎臟GFR之間的相關(guān)性分析結(jié)果顯示AQP1-4蛋白相對表達(dá)量與積水側(cè)腎臟GFR之間的相關(guān)性系數(shù)r分別為0.690、0.705、0.691和0.750。P值分別為0.027、0.023、0.027和0.012,均0.05,說明積水腎臟中AQP1-4蛋白相對表達(dá)量與患側(cè)腎臟GFR之間呈正相關(guān)。積水側(cè)腎臟腎實(shí)質(zhì)厚度與積水側(cè)腎臟GFR之間的相關(guān)性分析結(jié)果顯示積水側(cè)腎臟腎實(shí)質(zhì)厚度與積水側(cè)腎臟GFR之間的相關(guān)性系數(shù)r=0.728,P值為0.017,P0.05,說明積水側(cè)腎臟腎實(shí)質(zhì)厚度與GFR之間呈正相關(guān)。 結(jié)論 通過上述三部分的研究得出以下結(jié)論。 1.AQP1-4 mRNA和蛋白的表達(dá)在先天性積水腎臟中呈低表達(dá),并且隨著積水程度的加重,AQP1-4 mRNA和蛋白的表達(dá)越來越低。這提示在人類先天性積水腎臟中AQP1-4 mRNA和蛋白的表達(dá)量的降低與超聲分級的腎積水程度的加重成一定的比例,AQP1-4的表達(dá)降低可能是引起積水腎臟形態(tài)功能改變的早期因素之一。 2AQP1-4 mRNA和蛋白在IVP不顯影積水腎臟中的表達(dá)明顯下降。這提示AQP1-4在先天性積水腎臟中的表達(dá)降低,且隨著IVP顯影情況的不同而出現(xiàn)明顯變化,表明AQP1-4在腎積水發(fā)展進(jìn)程中可能與腎臟分泌功能的下降有一定的關(guān)系。 3.小兒先天性積水腎臟中AQP1-4 mRNA和蛋白表達(dá)均下調(diào),且隨著積水腎臟病理改變的嚴(yán)重程度而變化。提示AQP1-4表達(dá)水平的變化可能在先天性腎積水的病理發(fā)展過程中發(fā)揮著一定的作用。 4.積水腎臟中AQP1-4蛋白相對表達(dá)量與腎實(shí)質(zhì)厚度、腎臟GFR之間呈正相關(guān)。這提示AQP1-4蛋白表達(dá)量下降與積水腎實(shí)質(zhì)厚度和積水腎臟GFR的變化有一定的相關(guān)性,為進(jìn)一步了解腎實(shí)質(zhì)厚度越薄腎臟尿液濃縮稀釋功能越差現(xiàn)象的機(jī)理研究提供了客觀依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R726.9

【引證文獻(xiàn)】

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1 林曾萍;變應(yīng)性鼻炎小鼠模型建立及鼻粘膜水通道蛋白5的表達(dá)及意義[D];遵義醫(yī)學(xué)院;2014年

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本文編號：2627335