【摘要】： 目的:在膽汁淤積性肝病中,疏水性膽汁酸在肝臟內(nèi)的蓄積被認(rèn)為能導(dǎo)致肝細(xì)胞毒性作用。疏水性膽汁酸通過(guò)致肝線粒體活性氧(ROS)產(chǎn)生和膜通透性轉(zhuǎn)換(MPT)引發(fā)線粒體功能紊亂,誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡、壞死產(chǎn)生毒性作用。本文通過(guò)建立疏水性膽汁酸致新鮮離體新生鼠肝線粒體損傷的模型,探討疏水性膽汁酸致新生鼠肝線粒體活性氧產(chǎn)生和膜通透性轉(zhuǎn)換的具體機(jī)制,并進(jìn)一步證明抗氧化和抗MPT處理的臨床價(jià)值。 方法:取健康6天齡近交系Wistar大鼠新生鼠,每十只作為一測(cè)量單位。采用乙醚麻醉后,剖腹取肝,收集十只肝臟稱重后勻漿,采用差速和密度梯度法分離提純線粒體。于線粒體懸液中加入不同濃度的甘氨鵝脫氧膽酸(GCDC),預(yù)先加入和不加入MPT抑制劑-環(huán)孢菌素A及三種抗氧化劑(褪黑素、β-胡羅卜素和α-生育酚),用分光光度計(jì)連續(xù)測(cè)量MPT 5分鐘,觀察膽汁酸濃度對(duì)MPT的影響,并比較不同預(yù)處理后MPT的改變值。電鏡觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)的改變。用流式細(xì)胞儀測(cè)定加入GCDC后1,3,5,10分鐘時(shí)線粒體ROS的產(chǎn)生量。觀察膽汁酸濃度對(duì)ROS產(chǎn)生的影響,比較不同預(yù)處理后ROS的增加量。測(cè)量指標(biāo)均取三次測(cè)量單位結(jié)果的平均值。 結(jié)果:線粒體內(nèi)活性氧產(chǎn)生和膜通透性轉(zhuǎn)換與加入膽汁酸的濃度及處理時(shí)間呈依賴關(guān)系:隨濃度的升高,時(shí)間的延長(zhǎng),線粒體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生量和膜通透性均增高,電鏡結(jié)果顯示加入膽汁酸后線粒體超微結(jié)構(gòu)的破壞較對(duì)照組明顯;抗MPT組線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換明顯抑制,活性氧產(chǎn)生較對(duì)照組明顯降低,電鏡結(jié)果顯示抗MPT組較對(duì)照組及抗氧化組線粒體超微結(jié)構(gòu)破壞明顯改善;抗氧化組線粒體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生較對(duì)照組明顯減少,膜通透性轉(zhuǎn)換較對(duì)照組明顯抑制,電鏡結(jié)果顯示抗氧化組較對(duì)照組線粒體超微結(jié)構(gòu)破壞明顯改善。 結(jié)論: 1.離體的新生鼠肝線粒體經(jīng)疏水性膽汁酸處理后,能迅速發(fā)生膜通透性轉(zhuǎn)換、活性氧產(chǎn)生和線粒體形態(tài)學(xué)的改變,這些改變同膽汁酸的濃度及處理時(shí)間呈劑量、時(shí)間依賴關(guān)系。 2.疏水性膽汁酸處理新生鼠肝線粒體后,線粒體活性氧產(chǎn)生與膜通透性轉(zhuǎn)換呈正相關(guān)。 3.抗氧化及抗MPT處理能明顯抑制由疏水性膽汁酸所致新生鼠肝線粒體活性氧產(chǎn)生、膜通透性轉(zhuǎn)換及線粒體形態(tài)學(xué)改變,具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。
【圖文】：

結(jié) 果1．不同濃度的 GCDC 致 MPT 變化與時(shí)間的關(guān)系以吸光度的減少量反映線粒體的腫脹程度和線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換（MPT）的發(fā)生，間接反映線粒體膜孔(MPTP)的開(kāi)放程度。不同濃度的 GCDC 均能誘導(dǎo)線粒體在 540nm下的吸光度迅速下降，，表明線粒體的腫脹發(fā)生與疏水性膽汁酸致 MPT 的變化作用有關(guān)。隨著 GCDC 濃度的上升以及反應(yīng)時(shí)間的推移，吸光度下降的越明顯，表明線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換的發(fā)生與膽汁酸的濃度以及反應(yīng)時(shí)間呈濃度、時(shí)間依賴關(guān)系（圖 5）。由 GCDC 引發(fā)線粒體 MPT 的改變及線粒體腫脹能被 5μM CsA（一種 MPT 抑制劑）明顯抑制，當(dāng) GCDC 濃度達(dá)到 400μM 時(shí)亦能產(chǎn)生此現(xiàn)象。

3．不同濃度的 GCDC 致線粒體 ROS 產(chǎn)生與時(shí)間的關(guān)系以平均熒光強(qiáng)度值代表新生鼠肝線粒體 ROS 產(chǎn)生值，反映線粒體內(nèi)氧化應(yīng)激程度。不同濃度的 GCDC 均能誘導(dǎo)肝線粒體 ROS 的產(chǎn)生，這表明 GCDC 能誘導(dǎo)新生鼠肝線粒體內(nèi)氧化應(yīng)激的發(fā)生。隨著 GCDC 濃度的上升以及反應(yīng)時(shí)間的推移，平均熒光強(qiáng)度上升的越明顯，這表明新生鼠肝線粒體內(nèi) ROS 產(chǎn)生與膽汁酸的濃度以及反應(yīng)時(shí)間呈濃度、時(shí)間依賴關(guān)系（表 2，圖 7）。同一時(shí)間點(diǎn)上，隨著膽汁酸濃度的上升（50-400μM），線粒體內(nèi) ROS 的產(chǎn)生呈上升趨勢(shì)。同一膽汁酸濃度條件下，隨著時(shí)間的推移（1’-10’）線粒體內(nèi) ROS 的產(chǎn)生亦呈上升趨勢(shì)。由 GCDC 引發(fā)線粒體內(nèi) ROS 的生成能被 5μM CsA 所明顯抑制，當(dāng) GCDC濃度達(dá)到 400μM 時(shí)亦能產(chǎn)生此現(xiàn)象。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R722.1

【參考文獻(xiàn)】

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1 侯建明;藍(lán)進(jìn);;重點(diǎn)補(bǔ)充維生素E、C和βC提高機(jī)體素質(zhì)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[J];實(shí)用醫(yī)藥雜志;2007年02期

2 薛敏波,洪昭毅;β—胡蘿卜素的應(yīng)用進(jìn)展[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(婦幼保健分冊(cè));1996年03期

3 劉麗君,彭建新,洪華珠,葉雯,喬媛媛;線粒體在細(xì)胞凋亡中的變化與作用[J];細(xì)胞生物學(xué)雜志;2005年02期

4 沈方,沈倩,夏強(qiáng);細(xì)胞凋亡與線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔的研究進(jìn)展[J];浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2005年02期

本文編號(hào)：2623576