【摘要】： 【目的】亞低溫(mild hypothermia)是治療新生兒缺氧缺血性腦損傷(hypoxic ischemic brain damage,HIBD)的一種有效的方法,可通過(guò)降低腦細(xì)胞的能量代謝、減少細(xì)胞毒性產(chǎn)物的積聚、對(duì)抗細(xì)胞壞死等途徑發(fā)揮腦保護(hù)作用。星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocyte,AST)是腦細(xì)胞的重要組成部分,在缺氧缺血(hypoxic-ischemia, HI)后的腦損傷與修復(fù)過(guò)程中扮演重要角色。既往研究重點(diǎn)多集中于亞低溫對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用,對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞影響的研究極少,是否存在保護(hù)作用及其機(jī)制并不明了。本研究采用在體7日齡新生大鼠腦缺氧缺血模型及體外培養(yǎng)海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞氧糖剝奪(oxygen-glucose deprivation, OGD)模型,觀(guān)察亞低溫對(duì)缺氧缺血性腦損傷后新生大鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響,探討亞低溫對(duì)未成熟腦缺氧缺血性損傷的保護(hù)機(jī)制。 【方法】(一)在體實(shí)驗(yàn)：首先制備大鼠腦缺氧缺血模型,7日齡大鼠左側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎后置于含8%氧氣的氮氧混合氣的37℃缺氧箱中缺氧2 h。對(duì)照組大鼠僅實(shí)施假手術(shù),不進(jìn)行缺氧缺血。術(shù)后動(dòng)物隨機(jī)分為常溫處理組、亞低溫治療組、常溫對(duì)照組、亞低溫對(duì)照組；分別在HI后24 h、72 h和7天制備腦片,通過(guò)免疫組化計(jì)數(shù)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)陽(yáng)性細(xì)胞來(lái)評(píng)價(jià)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖的變化；通過(guò)免疫組化雙標(biāo)計(jì)數(shù)GFAP與caspase-3雙陽(yáng)性細(xì)胞檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡變化。(二)體外實(shí)驗(yàn)：培養(yǎng)1日齡大鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞,采用氧糖剝奪(OGD)方法以模擬在體缺氧缺血損傷過(guò)程,采用CCK-8、Tunel及DAPI染色觀(guān)察亞低溫處理后星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖和凋亡變化。 【結(jié)果】大鼠海馬區(qū)域GFAP染色結(jié)果顯示,HI后72 h和7天亞低溫治療組GFAP陽(yáng)性細(xì)胞低于常溫組,同一時(shí)間點(diǎn)兩組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；HI后72 h常溫處理組海馬部位84.5%GFAP陽(yáng)性細(xì)胞發(fā)生Caspase-3共表達(dá),而亞低溫治療組僅32.3%。體外實(shí)驗(yàn)顯示,OGD后亞低溫處理組細(xì)胞腫脹較常溫處理組輕；CCK-8結(jié)果顯示亞低溫治療組AST增殖明顯低于常溫處理組(P0.05)；亞低溫治療組較常溫處理組凋亡減少,Tunel陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少(P0.05)。 【結(jié)論】亞低溫能抑制新生大鼠HI損傷后海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖,減輕其凋亡
【圖文】：

原代及傳代AST形態(tài)大鼠大腦海馬細(xì)胞在接利，后3h左右開(kāi)始貼壁，隨后細(xì)胞由漂浮時(shí)的球形變形為卵圓形及多角形或不規(guī)則形，變形細(xì)胞常于24h內(nèi)伸出突起，24h后，所有變形細(xì)胞均已貼壁。原代培養(yǎng)細(xì)胞成分較多，主要包括AST、神經(jīng)元、纖維細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞。AST扁平，遮光差，圓形或多角形，輪廓清楚。AST互相連接成網(wǎng)狀。原代培養(yǎng)的AST可在9一12天左右生長(zhǎng)至完全融合。傳代培養(yǎng)的單層貼壁，形態(tài)伸展，胞體較大而扁，，形狀不規(guī)則，細(xì)胞核圓形或卵圓形。AST有較強(qiáng)的分裂增殖能力，可在5天左右生長(zhǎng)至完全融合。以AST特異性標(biāo)志蛋白GFAP染色觀(guān)察AST細(xì)胞形態(tài)及鑒定AST純度。G隊(duì)P陽(yáng)性的AST呈紅色薄紗樣細(xì)網(wǎng)狀，形態(tài)舒展，不規(guī)則。GFAP染色純度鑒定與DAPI染色細(xì)胞相比較，99%以上的細(xì)胞GFAP陽(yáng)性的AST，符合本實(shí)驗(yàn)對(duì)AST純度的要求。

復(fù)旦大學(xué)碩士學(xué)位論文一A為原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞在倒置顯微鏡20倍物鏡下的細(xì)胞形態(tài)。圖4傳代后AST經(jīng)GFAP染色后在熒光顯微鏡5倍、20倍、40倍物鏡下觀(guān)察到D模型建立的鑒定CK一8檢測(cè)OGD的細(xì)胞毒性GD0.5h、1hCCK一8，OGD組AST與對(duì)照組相t匕，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Ph、4hOGD組與對(duì)照組相t匕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Zh組h組與4h組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。該結(jié)果提示OGDST產(chǎn)生顯著毒性，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)毒性加重，3h和4h時(shí)AST出
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類(lèi)號(hào)】：R722.1

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本文編號(hào)：2623322