【摘要】：目的:中性粒細胞可通過形成中性粒細胞胞外捕獲網(wǎng)(neutrophil extracellular traps,NETs)發(fā)揮重要的免疫調控作用。機體NETs的免疫反應和表達量與疾病病癥存在一定的相關性。流行于荒漠地帶嬰兒利什曼感染誘發(fā)的內臟利什曼病(亦稱黑熱病)在我國流行區(qū)最廣,危害最嚴重,尚無有效防制措施。研究我國嬰兒利什曼原蟲感染在中性粒細胞形成NETs方面的作用及其機制,對了解該原蟲感染免疫調控機制和探索潛在治療靶標提供重要的理論依據(jù)和分子基礎。本研究采用致荒漠型黑熱病的嬰兒利什曼原蟲新疆伽師株(MHOM/CN/2008/JIASHI-5),以下簡稱嬰兒利什曼原蟲,建立嬰兒利什曼原蟲感染小鼠模型,分析嬰兒利什曼原蟲感染對宿主小鼠外周血中性粒細胞產(chǎn)生NETs能力的影響,并進一步探索嬰兒利什曼原蟲誘導NETs形成的機制。方法:以腹腔接種的方式,建立嬰兒利什曼原蟲感染BALB/c小鼠模型。分別采集感染12周小鼠和正常小鼠外周血,分離純化中性粒細胞。體外佛波酯(PMA)誘導中性粒細胞形成NETs。通過激光共聚焦掃描顯微成像技術和流式細胞分析術,定性和定量比較嬰兒利什曼原蟲感染小鼠與未感染小鼠中性粒細胞形成NETs的差異,分析嬰兒利什曼原蟲感染對宿主中性粒細胞形成NETs能力的影響。采集正常小鼠外周血,分離純化中性粒細胞。分別采用封閉酯氧素A4受體的拮抗劑(Boc)或刺激劑酯氧素A4(LXA4)預處理中性粒細胞以封閉或激活酯氧素A4受體。通過激光共聚焦掃描顯微成像技術、游離dsDNA濃度測定和流式細胞分析術,比較不同實驗處理組中性粒細胞在嬰兒利什曼原蟲前鞭毛體誘導下形成NETS的差異,分析酯氧素A4受體在嬰兒利什曼原蟲前鞭毛體誘導中性粒細胞形成NETs中的作用。利用1.25%二甲基亞砜(DMSO)誘導HL-60細胞分化為類中性粒細胞,基于RNA干擾(RNAi)技術構建酯氧素A4受體基因表達下調的類中性粒細胞模型。流式細胞分析術比較分析酯氧素A4受體基因表達下調的細胞在嬰兒利什曼原蟲前鞭毛體刺激下H3Cit(NETs標志物)表達的變化,進一步論證酯氧素A4受體在嬰兒利什曼原蟲前鞭毛體誘導中性粒細胞釋放NETs中的作用。結果:1.激光共聚焦掃描顯微鏡成像發(fā)現(xiàn),PMA體外刺激下,來源于嬰兒利什曼原蟲前鞭毛體感染小鼠的中性粒細胞形成NETs的比例增多,絲狀或網(wǎng)狀結構明顯,附著在DNA骨架上的瓜氨酸化組蛋白H3(H3Cit)和髓過氧化物聚合酶(MPO)顆粒物的熒光數(shù)量增多。流式分析發(fā)現(xiàn),H3Cit+MPO+中性粒細胞占總中性粒細胞的比例為(1.880±0.251)%,未感染小鼠的中性粒細胞的H3Cit+MPO+中性粒細胞占比為(0.623±0.087)%,感染小鼠的比例明顯高于未感染小鼠(P=0.0014)。2.嬰兒利什曼原蟲前鞭毛體可有效誘導中性粒細胞形成NETs(P0.01);而拮抗劑Boc封閉酯氧素A4受體后的中性粒細胞,在嬰兒利什曼原蟲前鞭毛體誘導下NETs的釋放量顯著降低(0.01),但Boc無法完全抑制嬰兒利什曼原蟲前鞭毛體誘導NETs的形成;激活劑LXA4能一定程度誘導NETs的釋放(P0.01);拮抗劑Boc可逆轉LXA4的激活效應(P0.01)。3.HL-60細胞分化的類中性粒細胞,在嬰兒利什曼原蟲前鞭毛體誘導下H3Cit+類中性粒細胞的顯著增高(P0.01)。酯氧素A4受體基因表達下調的類中性粒細胞相對未干擾的類中性粒細胞,在嬰兒利什曼原蟲前鞭毛體誘導下,H3Cit+類中性粒細胞比例顯著降低(P0.01)。結論:1.我國嬰兒利什曼原蟲感染可改變宿主中性粒細胞免疫狀態(tài),顯著增強中性粒細胞形成NETs的能力,并可能下調宿主免疫力。2.酯氧素A4受體是介導嬰兒利什曼原蟲前鞭毛體誘導中性粒細胞形成NETs的受體之一。3.中性粒細胞表面的酯氧素A4受體在利什曼原蟲感染宿主細胞中發(fā)揮重要作用,酯氧素A4受體可作為控制黑熱病的一個潛在靶點。
【圖文】：

膊≡し攬刂浦行募納，

本文編號：2619009