【摘要】：目的:分別將VAN、VAD兒童糞便移植入無菌小鼠體內(nèi),探索不同VA營養(yǎng)水平腸道菌群對無菌鼠腸道粘膜屏障功能的影響。方法:收集重慶渝中區(qū)幼兒園血清視黃醇水平≥1.05mmol/L(VA充足)或0.70mmol/L(VA缺乏)的健康兒童糞便,分別移植給四周齡Balb/c無菌小鼠后,構(gòu)建VAN優(yōu)勢菌群作用小鼠組(VAN-FMT)及VAD優(yōu)勢菌群作用小鼠組(VAD-FMT)。28天后,HE染色觀察小鼠小腸及結(jié)腸組織病理形態(tài)變化;Western blotting檢測小鼠小腸組織緊密連接相關(guān)蛋白Occludin和Claudin-1的表達變化;ELISA檢測小鼠血清DAO、IgA及盲腸糞便SIgA的含量;流式細胞儀檢測Peyper Patch結(jié)中樹突狀細胞、腸系膜淋巴結(jié)中B細胞、上皮間淋巴細胞(IELs)、固有層T淋巴細胞、脾臟中Treg細胞及T細胞亞群的比例。16s rRNA測序技術(shù)對小鼠結(jié)腸粘膜菌群進行檢測。結(jié)果:實驗期間各組小鼠一切正常,糞菌移植4周后各組間小鼠體重?zé)o統(tǒng)計學(xué)差異。HE染色發(fā)現(xiàn)VAN-FMT組小鼠的小腸及結(jié)腸粘膜發(fā)育均較VAD-FMT及無菌小鼠成熟,且VAD-FMT組小鼠結(jié)腸黏膜及黏膜下層有大量炎性細胞浸潤。VAN-FMT小鼠小腸Occludin和Claudin-1的表達水平較VAD-FMT及無菌小鼠均明顯升高(P(27)0.01,P(27)0.001),而VAD-FMT組僅Occludin蛋白表達水平較無菌小鼠明顯增加(P(27)0.01)。VAN-FMT小鼠血清DAO水平顯著低于VAD-FMT及無菌小鼠組。VAN-FMT小鼠糞便SIgA含量顯著高于無菌對照小鼠(P(27)0.05),SIgA含量在VAD-FMT及無菌小鼠組間無統(tǒng)計學(xué)差異;血清IgA濃度在三組間無顯著差異。VAN-FMT小鼠MLN中B淋巴細胞的比例顯著低于VAD-FMT組(P(27)0.05)及無菌小鼠(P(27)0.001),同時VAD-FMT組MLN中B淋巴細胞比例也明顯低于無菌小鼠組(P(27)0.05)。VAN-FMT組小鼠PP結(jié)中DCs的比例顯著高于VAD-FMT組(P(27)0.001)和無菌小鼠組(P(27)0.05),而VAD-FMT小鼠的DCs比例卻顯著低于無菌小鼠(P(27)0.05)。三組小鼠腸上皮間淋巴細胞中CD8~+TCRgd~+T淋巴細胞的百分比變化無統(tǒng)計學(xué)差異。小腸固有層中的CD4~+T淋巴細胞的比例在VAN-FMT組(P(27)0.001)及VAD-FMT組(P(27)0.001)均顯著高于無菌小鼠,但VAN-FMT與VAD-FMT兩組間無統(tǒng)計學(xué)意義。LPLs中的CD8~+T淋巴細胞的比例在三組間無顯著性差異。同時發(fā)現(xiàn)VAN-FMT小鼠固有層中CD4~+CD8~+雙陽性T淋巴細胞比例較VAD-FMT(P(27)0.05)及無菌小鼠(P(27)0.01)均顯著增加,但后兩組間無統(tǒng)計學(xué)差異。16s rRNA測序分析結(jié)果顯示,VAN-FMT及VAD-FMT小鼠結(jié)腸黏膜菌群組成具有很高的相似性,且兩組的ACE、Chao、Shannon、Simpson多樣性指數(shù)無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。在門水平兩組均以厚壁菌門及擬桿菌門為主,其中Proteobacteria在VAN-FMT小鼠顯著增加(P0.05);在屬水平,VAN-FMT組豐度最高的菌屬為Bacteroides,其中Helicobacter(P=0.03)及Lachnospiraceae(P=0.005)顯著性增加;而VAD-FMT組豐度最高的菌屬為Staphylococcus。LEfSe分析顯示VAN-FMT組有29個對分組有顯著差異的物種,而VAD-FMT組有10個對分組有顯著差異的物種。結(jié)論:VAN兒童腸道菌群的糞菌移植可顯著促進無菌小鼠的腸道發(fā)育成熟,上調(diào)腸上皮細胞間的緊密連接相關(guān)蛋白Occludin和Claudin-1的表達水平,增強小腸上皮屏障功能。同時VAN-FMT降低MLN中B淋巴細胞比例,誘導(dǎo)PP結(jié)中的樹突狀細胞成熟分化,促進B細胞從MLN向腸道歸巢并分泌IgA,增加固有層中CD4~+、CD4~+CD8~+T細胞比例,表明VAN兒童腸道菌群可能是通過其優(yōu)勢菌屬Bacteroides誘導(dǎo)無菌鼠腸道天然粘膜免疫活性;而VAD兒童腸道菌群則以機會致病菌葡萄球菌屬為主,且Prevotella增加,從而導(dǎo)致VAD-FMT小鼠腸道出現(xiàn)炎癥,對無菌鼠腸道粘膜免疫調(diào)節(jié)作用減弱。
【圖文】：

version 5.0 軟件進行統(tǒng)計。兩組間豐度的比較美吉生物醫(yī)藥科技有限公司提供的 I-Sanger 顯著性的差異。及體重的實驗周期內(nèi)，糞菌液移植前各組小鼠體質(zhì)量飲食飲水及大小便正常。實驗期間，各組小結(jié)束時無菌小鼠組、VAN 菌群移植組及 VAD統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）（見圖 1）。

組小鼠結(jié)腸黏膜完整、光滑，黏膜上皮完整、連續(xù)，腺體排列規(guī)則整齊，，結(jié)構(gòu)清晰，無炎性細胞浸潤。而 VAD-FMT 組的結(jié)腸黏膜完整，但腺體排列存在部分破壞，黏膜及黏膜下層有大量炎性細胞浸潤（圖 2）。表 1 FMT 小鼠小腸形態(tài)學(xué)比較（ ±s,μm）Table 1 Morphological comparison of small intestine in the mice following FMT.組別 小腸絨毛高度 小腸隱窩深度 黏膜層厚度 全層厚度Control 295.1±8.11 50.12±4.828 390.5±9.869 413.3±11.31VAN-FMT 352.6±7.749a*100.5±7.303a***471.0±31.65a*514.1±37.31a**VAD-FMT 308.5±43.39 54.32±4.906b***387.6±41.67b*407.8±34.29b**Note:aCompared with Control,bCompared with VAN-FMT*P＜0.05;**P<0.01;***P<0.001
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R725.7

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本文編號：2616002