【摘要】： 急性胃黏膜損傷是嚴(yán)重感染、外傷、休克等危重癥的常見并發(fā)癥,在上述疾病中發(fā)病率可高達(dá)60-100%;未經(jīng)治療者大出血率達(dá)15%,常常危及生命。其發(fā)生原因是由于胃黏膜保護(hù)機(jī)制削弱,損傷因素相對增強(qiáng)所致。近年研究發(fā)現(xiàn)肽類物質(zhì)在胃粘膜損傷的保護(hù)和修復(fù)方面發(fā)揮重要作用。胃黏膜上皮的生長、更新和修復(fù)的過程是受到嚴(yán)格調(diào)控的,這一調(diào)控機(jī)制主要來自黏膜本身,有多種肽類物質(zhì)參與,其修復(fù)能力可能與這些肽類物質(zhì)的表達(dá)水平有關(guān)。在兒科危重癥中,重癥感染是急性胃黏膜損傷的常見原因。在重癥感染內(nèi)毒素血癥時(shí)肽類物質(zhì)如何發(fā)揮對胃粘膜損傷的保護(hù)和修復(fù)作用目前尚不清楚,是否是通過傳統(tǒng)的前列腺素途徑發(fā)揮作用,尚缺少研究報(bào)道。 乳癌相關(guān)肽(pS2)即三葉因子1(TFF1)為三葉肽家族一成員,其結(jié)構(gòu)是6個(gè)半胱氨酸殘基形成3個(gè)鏈內(nèi)二硫橋。pS2通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖而使胃黏膜具有防御和修復(fù)功能,其對不同細(xì)胞系具有促有絲分裂作用。pS2在內(nèi)毒素血癥幼年大鼠胃粘膜中的表達(dá)變化及對胃粘膜的保護(hù)和修復(fù)作用機(jī)制尚不清楚。 轉(zhuǎn)化生長因子-alpha(TGF-α)是表皮生長因子家族中一類胃黏膜損傷后修復(fù)的主要調(diào)節(jié)肽,能促進(jìn)胃黏膜上皮的代謝和生長。由于胃黏膜本身合成TGF-α,所以TGF-α是維持胃黏膜完整性最重要的肽類物質(zhì)。在內(nèi)毒素血癥幼年大鼠胃粘膜中TGF-α表達(dá)變化及pS2基因、TGF-α基因、表達(dá)的時(shí)相關(guān)系尚需研究。 環(huán)氧合酶-2(COX-2)為COX同工酶的誘導(dǎo)型,是前列腺素(PGs)合成過程中一個(gè)重要的限速酶。前列腺素是一種脂質(zhì),主要在精囊、腎髓質(zhì)、肺和胃腸道中合成。PG的不斷產(chǎn)生和釋放對胃黏膜細(xì)胞起保護(hù)作用,促進(jìn)胃黏膜細(xì)胞愈合。在內(nèi)毒素血癥幼年大鼠胃粘膜中COX-2表達(dá)變化及調(diào)控、前列腺素E_2(Prostaglandin E_2,PGE_2)濃度變化尚不十分清楚。 誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)是NOS同工酶的誘導(dǎo)型,內(nèi)源性一氧化氮(NO)的產(chǎn)量有賴于細(xì)胞iNOS的表達(dá)量。在內(nèi)毒素血癥幼年大鼠胃粘膜中iNOS表達(dá)變化及調(diào)控、NO含量變化及對胃粘膜的作用尚不十分清楚。 增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)是一種分子量為35712u(36000道爾頓)核蛋白,是細(xì)胞DNA合成不可缺少的因子,存在于細(xì)胞核內(nèi)不同部位,PC-NA的出現(xiàn)與細(xì)胞增殖周期密切相關(guān),是反映細(xì)胞增殖活性的重要生物學(xué)指標(biāo)。PCNA在內(nèi)毒素血癥幼年大鼠胃粘膜中的變化尚未見報(bào)道。 血小板活化因子(PAF)是迄今發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性潰瘍形成介子中最強(qiáng)的一個(gè),對其它炎性細(xì)胞因子的作用起增強(qiáng)作用。PAF受體拮抗劑能顯著改變內(nèi)毒素或PAF引起的血流動力學(xué)變化及組織器官的損傷。 本研究的目的是通過觀察幼年大鼠內(nèi)毒素血癥時(shí)胃黏膜上皮細(xì)胞、壁細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)和PGE_2、NO的變化,胃黏膜COX-2、iNOS、pS2、TGF-α蛋白及mRNA和PCNA蛋白表達(dá)變化,以及PAF受體拮抗劑對其影響,從細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)水平、蛋白質(zhì)水平及分子水平探討內(nèi)毒素血癥幼年大鼠胃黏膜細(xì)胞保護(hù)作用及PAF受體拮抗劑對其影響,研究胃粘膜損傷保護(hù)和修復(fù)調(diào)控的分子機(jī)制,為胃粘膜損傷的預(yù)防和治療開辟新的途徑,也為三葉肽制劑的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。 材料和方法 1.材料 用腹腔注射內(nèi)毒素(5 mg/kg O_(55):B_5脂多糖)方法制備18日齡Wistar大鼠內(nèi)毒素血癥動物模型,腹腔注射同等量生理鹽水為對照組,腹腔注射內(nèi)毒素前0.5 h腹腔注射PAF受體拮抗劑(5 mg/kg BN52021 GinkgolideB)為預(yù)防組,腹腔注射內(nèi)毒素后0.5 h腹腔注射PAF受體拮抗劑(5 mg/kgBN52021 GinkgolideB)為治療組。分別于內(nèi)毒素腹腔注射后1.5,3,6,24,48,72 h斷頭處死動物,大體觀察胃黏膜損傷情況,記錄潰瘍指數(shù)(UI);在腺胃區(qū)胃大彎處取0.5cm×0.5cm胃組織置入4%甲醛溶液中固定保存、取0.1cm×0.5cm胃黏膜切成1mm~3小塊若干,投入2.5%戊二醛液中固定保存;留胃黏膜約0.5cm×0.5cm稱重;其余部分用生理鹽水沖洗3次,放入去RNA酶的試管中,液氮速凍,深低溫冰箱-70℃保存。每組每時(shí)間點(diǎn)8只。 2.方法 按Guth標(biāo)準(zhǔn)積分判定胃黏膜潰瘍指數(shù)(UI),H-E染色光學(xué)顯微鏡檢查胃黏膜病理改變,透射電鏡觀察胃黏膜上皮細(xì)胞、壁細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變,采用放射免疫法測定胃黏膜PGE_2濃度,硝酸還原酶的化學(xué)比色法測定胃黏膜NO含量;免疫組織化學(xué)SP方法測定pS2、TGF-α、COX-2、iNOS及PC-NA蛋白的表達(dá),半定量RT-PCR法測定pS2、TGF-α、COX-2及iNOSmRNA的表達(dá)。用SPSS 10.0軟件系統(tǒng)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,組間比較采用方差分析。 結(jié)果 一、內(nèi)毒素血癥幼年大鼠胃黏膜上皮細(xì)胞、壁細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化及PAF受體拮抗劑對其影響 大體觀察LPS組腹腔注射內(nèi)毒素后6 h胃黏膜損傷最重,表面可見大片糜爛、出血、條索狀壞死,與胃縱軸平行,損傷主要見于腺胃區(qū);光鏡下黏膜表面上皮廣泛脫落,黏膜內(nèi)有出血,炎性細(xì)胞浸潤,核碎裂、固縮,凋亡小體出現(xiàn),腺體受損。此時(shí)胃黏膜UI記分最高,與對照組比較或各時(shí)間點(diǎn)比較,差異均非常顯著(P0.01);PAF受體拮抗劑預(yù)防組和治療組胃黏膜損傷程度明顯減輕,UI記分顯著降低。透射電鏡觀察可見LPS組6 h表面上皮細(xì)胞細(xì)胞間隙增寬,腔膜面破壞,細(xì)胞間緊密連接不連續(xù),短小的微絨毛減少,線粒體嚴(yán)重腫脹,脊斷裂甚至消失,呈空泡變性,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張,核糖體脫落,染色質(zhì)濃縮分部在核的周邊,可見核固縮,核膜間隙增寬;壁細(xì)胞腫脹,可見鹽酸小管擴(kuò)張,部分有破壞呈空泡樣改變,線粒體增多,部分空泡樣改變,胞質(zhì)內(nèi)核糖體脫落,滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張。 二、內(nèi)毒素血癥幼年大鼠胃黏膜COX-2、iNOS、PGE_2、NO變化及PAF受體拮抗劑對其影響 LPS組腹腔注射內(nèi)毒素后6 h胃黏膜PGE_2濃度最低,此時(shí)LPS組較對照組PGE_2濃度明顯降低(P0.01),PAF受體拮抗劑預(yù)防組、PAF受體拮抗劑治療組較LPS組明顯增高(P0.01),PAF受體拮抗劑預(yù)防組、PAF受體拮抗劑治療組較對照組明顯增高(P0.05)。LPS組腹腔注射內(nèi)毒素后6 h胃黏膜NO含量最高,此時(shí)LPS組較對照組NO含量明顯增高(P0.01),PAF受體拮抗劑預(yù)防組、PAF受體拮抗劑治療組較LPS組明顯降低(P0.01);PAF受體拮抗劑預(yù)防組、PAF受體拮抗劑治療組較對照組明顯增高(P0.05)。 對照組胃黏膜組織未見COX-2、iNOS蛋白及mRNA的表達(dá)。LPS組腹腔注射內(nèi)毒素后6 h COX-2蛋白在胃黏膜組織胞漿表達(dá),48 h明顯增高,其mRNA水平亦上調(diào);PAF受體拮抗劑預(yù)防組和治療組6 h COX-2蛋白表達(dá)明顯增高、mRNA水平明顯上調(diào)。LPS組腹腔注射內(nèi)毒素后1.5h胃黏膜組織胞漿iNOS蛋白表達(dá),6 h明顯增高,24 h最高,48 h下降,72 h仍未恢復(fù)正常;其mRNA水平的表達(dá)變化與iNOS蛋白表達(dá)趨勢相同。PAF受體拮抗劑預(yù)防組和治療組3 h iNOS蛋白表達(dá),6 h明顯增高,48 h下降,72h同正常對照組;其mRNA水平的表達(dá)變化與iNOS蛋白表達(dá)趨勢相同。 三、內(nèi)毒素血癥幼年大鼠胃黏膜pS2、TGF-α和PCNA表達(dá)變化及PAF受體拮抗劑對其影響 對照組胃黏膜組織胞核PCNA陽性染色很多,LPS組腹腔注射內(nèi)毒素后3 h PCNA的表達(dá)就明顯減低,6 h最低,24 h有所恢復(fù),72 h未完全恢復(fù)正常。PAF受體拮抗劑預(yù)防組和治療組胃黏膜組織胞核PCNA陽性染色無明顯減少。對照組胃黏膜組織有pS2 mRNA、TGF-αmRNA表達(dá)。LPS組內(nèi)毒素腹腔注射后1.5 h胃黏膜中pS2基因表達(dá)減弱,3 h恢復(fù),6 h明顯高于對照組,24 h最高,48 h-72 h有所下降,但仍明顯高于對照組。PAF受體拮抗劑預(yù)防組和治療組3h pS2 mRNA的表達(dá)就明顯增強(qiáng)。LPS組腹腔注射內(nèi)毒素后6h胃黏膜中TGF-αmRNA的表達(dá)明顯增強(qiáng),6 h-48h最強(qiáng),72 h有所下降,仍高于正常對照組。PAF受體拮抗劑預(yù)防組和治療組TGF-αmRNA的表達(dá)48 h恢復(fù)正常。免疫組化證實(shí)了胃黏膜pS2、TGF-α表達(dá)變化。 結(jié)論 1.腹腔注射內(nèi)毒素可致幼年大鼠急性胃黏膜損傷,胃黏膜上皮細(xì)胞、壁細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)生變化;PAF受體拮抗劑可明顯減輕內(nèi)毒素血癥時(shí)幼年大鼠急性胃黏膜損傷,由此得出PAF可能是引起幼年大鼠內(nèi)毒素血癥時(shí)急性胃黏膜損傷的重要因素。 2.內(nèi)毒素血癥時(shí)胃黏膜COX-2 mRNA、iNOS mRNA表達(dá)上調(diào),COX-2、iNOS蛋白表達(dá)增強(qiáng)。PAF受體拮抗劑可改善COX-2的表達(dá),下調(diào)iNOS表達(dá)水平,在減輕急性胃黏膜損傷的同時(shí)可能有助于胃黏膜損傷的愈合。 內(nèi)毒素血癥時(shí)胃黏膜PGE_2下降,NO含量增高,誘發(fā)急性胃黏膜損傷;PAF受體拮抗劑可影響胃黏膜PGE_2濃度、NO含量,有助于其發(fā)揮對胃黏膜的保護(hù)作用。 3.內(nèi)毒素血癥時(shí)胃黏膜PCNA表達(dá)減少,胃黏膜損傷恢復(fù)PCNA表達(dá)也增加;胃黏膜pS2 mRNA、TGF-αmRNA表達(dá)上調(diào),pS2、TGF-α蛋白表達(dá)增強(qiáng),可能通過介導(dǎo)細(xì)胞增殖參與急性胃黏膜損傷的保護(hù)和修復(fù)。
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號】：R725.7

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2614154