【摘要】：目的構建氯化鈷(CoCl_2)作用下的神經膠質瘤U251細胞缺氧模型和左側頸總動脈結扎的小鼠缺血模型并對其效果進行評價以后,討論促紅細胞生成素(Erythropoietin,EPO)在缺氧條件下對U251細胞小泛素樣修飾蛋白-1(small ubiquitin-like modifier,SUMO-1)、葡萄糖轉運蛋白-1(glucose transporter-1,GLUT-1)表達的影響以及在缺血條件下對小鼠堿性髓鞘蛋白(myelin basic protein,MBP)表達的影響,為研究EPO對新生兒缺氧缺血性腦病的神經細胞保護機制奠定基礎。方法1.CCK-8法檢測不同濃度、不同時間CoCl_2對U251細胞活性的影響。2.實時熒光定量PCR(quantitative real-time RT-PCR,qPCR)法檢測不同濃度CoCl_2作用下不同組U251細胞中缺氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible-1,HIF-1α)mRNA表達的變化。3.細胞流式術檢測CoC1_2對U251細胞活性氧(ROS)水平的影響。4.U251細胞缺氧模型構建成功后,CCK-8法測定缺氧條件下EPO對U251細胞增殖的影響。5.高通量測序技術篩選CoCl_2組和CoCl_2+EPO組的差異表達基因。6.qPCR法對高通量測序結果中的和神經細胞保護作用相關的差異表達基因SUMO-1、GLUT-1進行驗證。7.構建小鼠左側頸總動脈結扎的缺血模型:取46只(雌雄各半)3周齡昆明小白鼠隨機分成假手術組、缺血組(各組n=23),假手術組僅分離左側頸總動脈,缺血組分離左側頸總動脈并結扎,術后2周頸椎脫臼處死,提取小鼠腦組織的mRNA,qPCR法檢測MBP基因表達的變化。8.小鼠缺血模型構建成功后,取46只(雌雄各半)3周齡的小白鼠隨機分成缺血組、EPO治療組(各組n=23),EP0治療組按0.01ml/g,1次/日,腹腔注射EPO,缺血組腹腔注射等量生理鹽水。1周后頸椎脫臼處死并提取小鼠腦組織mRNA,qPCR法檢測MBP基因表達的變化。結果1.通過CCK-8實驗和qPCR檢測HIF-1α實驗篩選出U251細胞的CoCl_2最佳濃度是400μmol/ml;流式細胞實驗顯示400μmol/ml CoCl_2組的活性氧強度顯著高于0μmol/ml CoCl_2組,差異具有統計學意義(P0.05)。2.CCK-8實驗檢測得出缺氧條件下EPO最佳濃度是75IU/ml。3.高通量測序技術篩選出CoCl_2組和CoCl_2+EPO組與神經保護相關的差異表達基因為SUMO-1、GLUT-1。通過qPCR法驗證,結果表明與高通量測序結果相符。4.小鼠在左側頸總動脈結扎術后2周,處死并提取腦組織中的mRNA,運用qPCR法檢測得出缺血組相比假手術組MBP表達量增高,差異具有統計學意義(P0.05),提示小鼠缺血性腦損傷模型構建成功。5.缺血性腦損傷模型構建成功以后,小鼠腹腔注射EPO 1周,處死并提取腦組織中的mRNA,運用qPCR法檢測得出EPO治療組相比缺血組MBP表達量降低,差異具有統計學意義(P0.05)。結論1.成功構建了U251細胞的CoCl_2缺氧模型,并研究得出EPO可以在缺氧條件下促進U251的增殖及SUMO-1、GLUT-1的表達。2.成功構建了小鼠左側頸總動脈結扎的缺血模型,并證實了EPO可以在小鼠缺血性腦損傷模型中降低MBP的表達。
【圖文】：

內蒙古醫(yī)科大學碩士研究生學位論文 細胞流式術測定 CoC12對 U251 細胞活性氧（ROS）強度的影響oC12誘導下的 U251 細胞缺氧環(huán)境，可以引起 U251 細胞損傷并生成粒體膜電位閾值，最終導致細胞毒性和細胞凋亡。通過采用 DCFH-胞給細胞裝載熒光探針觀察活性氧 ROS 水平變化情況，運用流式細得出，作用于 U251 細胞 48 小時以后 400μ mol/ml CoC12組細胞的顯高于 0μ mol/ml CoC12組細胞，差異具有統計學意義（P<0.05） 2）。

內蒙古醫(yī)科大學碩士研究生學位論文 細胞流式術測定 CoC12對 U251 細胞活性氧（ROS）強度的影響oC12誘導下的 U251 細胞缺氧環(huán)境，可以引起 U251 細胞損傷并生成粒體膜電位閾值，最終導致細胞毒性和細胞凋亡。通過采用 DCFH-胞給細胞裝載熒光探針觀察活性氧 ROS 水平變化情況，，運用流式細得出，作用于 U251 細胞 48 小時以后 400μ mol/ml CoC12組細胞的顯高于 0μ mol/ml CoC12組細胞，差異具有統計學意義（P<0.05） 2）。
【學位授予單位】：內蒙古醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R722.1

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本文編號：2610797