【摘要】：2008年以來(lái)我國(guó)手足口病年發(fā)病數(shù)及死亡病例數(shù)都占丙類(lèi)傳染病的第一位,是亟待解決的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題。手足口病重癥感染患者則會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀以及并發(fā)癥,嚴(yán)重危害嬰幼兒的健康。重癥手足口病的影響因素分析,對(duì)于手足口病特別是重癥手足口病的防治具有重要意義。越來(lái)越多的研究表明TRIM(Tripartite motif)蛋白家族在病毒誘導(dǎo)的固有免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。本課題以探索TRIM2在EV71觸發(fā)的固有免疫反應(yīng)中的作用及機(jī)制展開(kāi)研究,從而為EV71感染手足口病的防治提供思路。第一部分深圳市重癥手足口病相關(guān)危險(xiǎn)因素分析目的探討深圳市手足口病重癥病例的影響因素,為減少重癥手足口病的發(fā)生,降低手足口病的傷害提供科學(xué)參考。方法收集2012-2016年深圳市衛(wèi)計(jì)委指定的重癥手足口病收治醫(yī)院的727例重癥手足口病患者資料以及同期深圳市另外2家綜合醫(yī)院兒科或感染科的680例輕癥手足口病病例資料,采用單因素χ2檢驗(yàn)及多因素Logistic回歸分析對(duì)手足口病重癥病例發(fā)病危險(xiǎn)因素進(jìn)行分析。結(jié)果單因素χ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示性別、年齡、患兒職業(yè)分類(lèi)、戶(hù)口類(lèi)型、是否參加醫(yī)療保險(xiǎn)、喂養(yǎng)方式、發(fā)病前一個(gè)月是否接種疫苗、發(fā)熱、出疹、EV71、CA16等11個(gè)因素有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示:散居兒童、發(fā)熱以及感染EV71是手足口病重癥病例的影響因素,OR值(95%CI)分別為3.86(1.156～12.987)、6.836 2.315～20.184)和8.746(3.729～20.511)。第二部分TRIM2在EV71感染手足口病固有免疫反應(yīng)中的作用和機(jī)制研究目的研究顯示TRIM家族成員在病毒誘導(dǎo)的固有免疫中發(fā)揮作用,而TRIM2調(diào)控抗病毒固有免疫的機(jī)制目前并不清楚。本次課題旨在研究TRIM2在EV71誘導(dǎo)的固有免疫中發(fā)揮的作用及作用機(jī)制,以期為EV71感染致手足口病的臨床治療以及藥物和新型疫苗的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。方法1采用基因芯片檢測(cè)EV71感染THP1誘導(dǎo)分化成的巨噬細(xì)胞(t-M(?))后,TRIM家族分子表達(dá)變化情況,篩選表達(dá)差異變化有顯著性的TRIM分子。2采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證t-M(?)中篩選到的TRIM家族分子mRNA表達(dá)水平。3在t-M(?)中過(guò)表達(dá)TRIM2或以siRNA靶向干擾TRIM2后,給以EV71感染,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞因子mRNA表達(dá)變化情況。4在t-M(?)中過(guò)表達(dá)TRIM2或以siRNA靶向干擾TRIM2后,給以EV71感染,采用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)固有免疫信號(hào)通路中不同信號(hào)分子活化情況以及EV71結(jié)構(gòu)蛋白VP1的表達(dá)水平情況。5利用蛋白質(zhì)免疫共沉淀及Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TRIM2與MDA5的相互作用情況,以及TRIM2對(duì)MDA5泛素化的影響。結(jié)果1 EV71感染t-M(?)后,TRIM家族分子發(fā)生了不同程度表達(dá)變化,其中TRIM2表達(dá)下降最為顯著。2過(guò)表達(dá)TRIM2顯著抑制EV71感染誘導(dǎo)的細(xì)胞因子IL-6,TNF-α和CCL3的產(chǎn)生。干擾TRIM2表達(dá)促進(jìn)EV71感染誘導(dǎo)的細(xì)胞因子IL-6,TNF-α和CCL3的產(chǎn)生。3過(guò)表達(dá)TRIM2抑制MAPK和NF-κB通路中信號(hào)分子的活化,促進(jìn)EV71復(fù)制。干擾TRIM2表達(dá)后能促進(jìn)MAPK和NF-κB通路中信號(hào)分子活化,抑制EV71復(fù)制。4 TRIM2通過(guò)與模式識(shí)別受體MDA5相互作用,促進(jìn)MDA5的K48位泛素化降解,從而負(fù)向調(diào)控MDA5下游MAPK和NF-κB信號(hào)通路活化。結(jié)論1重癥手足口病影響因素眾多,散居兒童、發(fā)熱、有EV71感染是重癥手足口病的危險(xiǎn)因素。2 EV71感染后,TRIM2與模式識(shí)別受體MDA5相互作用,促進(jìn)MDA5的K48位泛素化,阻礙MAPK和NF-κB通路中各接頭分子的活化,抑制EV71誘導(dǎo)的細(xì)胞因子的產(chǎn)生,實(shí)現(xiàn)對(duì)EV71感染手足口病固有免疫反應(yīng)的負(fù)向調(diào)控。
【圖文】：

得到了與芯片一致的結(jié)果（圖3.1C）。結(jié)果顯示在 EV71 感染巨噬細(xì)胞中，TRIM25、TRIM14、TRIM69 和 TRIM21在 EV71 感染時(shí)表達(dá)上調(diào)，，其中 TRIM25 表達(dá)上調(diào)最為顯著。另外，在 EV71 感染后，TRIM2、TRIM44 和 TRIM32 發(fā)生了表達(dá)水平的降低，TRIM2 的表達(dá)下調(diào)最為明顯。提示這些 TRIM 分子在 EV71 感染固有免疫反應(yīng)過(guò)程中可能會(huì)發(fā)揮作用。在 EV71 感染巨噬細(xì)胞后，我們篩選到表達(dá)上調(diào)和下調(diào)最為顯著的兩個(gè)TRIM 分子中，TRIM25 在抗病毒固有免疫反應(yīng)中的調(diào)控作用已經(jīng)得證實(shí)。而TRIM2 在 EV71 感染免疫調(diào)控中的作用目前尚無(wú)報(bào)道

這三個(gè)質(zhì)粒進(jìn)行酶切檢驗(yàn)后電泳，1-5 道為 HA-TRIM2 不同的單克隆質(zhì)粒，6-10道為myc-TRIM2不同的單克隆質(zhì)粒，11-15道為flag-TRIM2不同的單克隆質(zhì)粒；M 道為 Marker。（D）以 HA-TRIM2，Myc-TRIM2，F(xiàn)lag-TRIM2 以及對(duì)應(yīng)標(biāo)簽的空載體作為對(duì)照轉(zhuǎn)染 HEK293T 細(xì)胞，48 小時(shí)后，提取細(xì)胞蛋白，利用對(duì)應(yīng)的標(biāo)簽抗體檢測(cè) TRIM2 的表達(dá)。3.3 過(guò)表達(dá) TRIM2 對(duì) EV71 誘導(dǎo)的細(xì)胞因子產(chǎn)生有抑制作用為了研究 TRIM2 在 EV71 感染引起的固有免疫反應(yīng)中的功能，我們利用上述構(gòu)建成功的 TRIM2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 t-M ，并觀察過(guò)表達(dá) TRIM2 對(duì)細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響。結(jié)果顯示，在 t-M 中轉(zhuǎn)染 HA-TRIM2 可以顯著提高 TRIM2 的 mRNA 和蛋白表達(dá)水平（3.3A、3.3B）。當(dāng)以 EV71 感染轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞時(shí)，TRIM2 過(guò)表達(dá)組與對(duì)照組相比，能夠顯著抑制細(xì)胞因子 IL-6、TNF-α 及 CCL3 的表達(dá)（圖 3.3C），說(shuō)明 TRIM2 對(duì) EV71 誘導(dǎo)的細(xì)胞因子產(chǎn)生具有抑制作用。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R725.1

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本文編號(hào)：2600891