【摘要】： 腸道病毒71型(Enterovirus 71, EV71)屬于小RNA病毒科腸道病毒屬的成員,最初由Schmidt等從腦脊液中分離出來,世界上許多國(guó)家相繼報(bào)道了EV71病毒在不同地區(qū)流行情況,近來在我國(guó)也呈逐年上升趨勢(shì),感染EV71后,除了可以引起手足口病、皰疹性咽峽炎以外,還可以導(dǎo)致無菌性腦膜炎、腦炎、脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹、神經(jīng)性肺水腫、心肌炎等疾病,嚴(yán)重威脅著兒童的生命健康。 EV71病毒由60個(gè)相同的亞單位構(gòu)成,每個(gè)亞單位均包含VP1～VP4四種結(jié)構(gòu)蛋白,據(jù)病毒衣殼蛋白VP1序列(891bp)的變異情況,將其分為A、B和C三個(gè)基因型,近年的研究表明[ 1 ],基因型B和C又可進(jìn)一步分為不同亞型(B1～B5和C1～C4)。目前對(duì)EV71的分子流行病學(xué)研究主要是VP1、VP4基因及5’-UTR區(qū)的變異,而VP1最具有研究?jī)r(jià)值,因?yàn)樗苯記Q定病毒的抗原性,是病毒主要的中和決定因子,有遺傳變異多樣性的特點(diǎn),5’-UTR結(jié)構(gòu)涉及病毒的宿主范圍和病毒的毒力等多個(gè)方面的功能。 腸道病毒71型遺傳學(xué)上具有多變性,同一地區(qū)不同時(shí)間流行的EV71易發(fā)生基因型轉(zhuǎn)換,導(dǎo)致臨床癥狀在不同地區(qū)和不同時(shí)間均有差異。大多在一周內(nèi)可恢復(fù),但少數(shù)低齡患兒可能只表現(xiàn)出中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染癥狀,增加了早期診斷的難度,目前,對(duì)EV71致病的分子機(jī)制了解還很少,通過何種受體進(jìn)入宿主細(xì)胞尚不明了,現(xiàn)在還沒有研制出安全有效的特效藥和疫苗,所以,對(duì)這種病原體及時(shí)快速的檢測(cè)對(duì)于手足口病的診治有著至關(guān)重要的作用。 目的 對(duì)西安地區(qū)腸道病毒71型流行株進(jìn)行分離鑒定,經(jīng)初步提純,建立一種新的快速EV71抗體ELISA檢測(cè)方法,以提純獲得的EV71病毒作為抗原免疫小鼠,制備腸道病毒71型西安株單克隆抗體,構(gòu)建出穩(wěn)定分泌表達(dá)的雜交瘤細(xì)胞株,測(cè)定腹水效價(jià),為以后研究EV71病毒的生物學(xué)功能及其早期診治防治奠定基礎(chǔ)。 方法 1.采集手足口病患兒咽部分泌物標(biāo)本進(jìn)行病毒分離和RT-PCR檢測(cè),利用免疫熒光技術(shù)進(jìn)行鑒定,并將提取的病毒RNA進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定; 2.用聚乙二醇(PEG)沉淀法將分離的EV71病毒進(jìn)行初步濃縮、提純,獲得大量高濃度的EV71抗原,然后直接應(yīng)用抗原包被酶標(biāo)板,用已知EV17抗體陽性血清鑒定所提純抗原的免疫活性; 3.用濃縮提純的EV71病毒作為免疫原免疫Balb/c小鼠,末次加強(qiáng)免疫后3天取脾細(xì)胞與骨髓瘤SP2/0進(jìn)行細(xì)胞融合,用HAT選擇培養(yǎng)基進(jìn)行篩選,經(jīng)過3次有限稀釋克隆化,ELISA反復(fù)篩選,獲得穩(wěn)定分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株,接種于小鼠體內(nèi)制備含有單克隆抗體的腹水,并檢測(cè)腹水效價(jià)。 結(jié)果 1.原始標(biāo)本直接用RT - PCR法擴(kuò)增,陽性7份,陽性率31.8% (7/22) ;接種于RD細(xì)胞后成功分離10份陽性標(biāo)本,陽性率為45.4% (10/22);然后運(yùn)用RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))從病毒培養(yǎng)上清中提取病毒RNA,發(fā)現(xiàn)病毒分離后再經(jīng)RT - PCR檢測(cè)的陽性率為68.1% , 2.病毒分離后經(jīng)RT-PCR檢測(cè)陽性條帶切下測(cè)序,所得基因序列同GENEBAND報(bào)道的西安地區(qū)EV71流行株序列號(hào)(EU812461)完全一致,免疫熒光鑒定結(jié)果陽性; 3.分離提純的EV71病毒作為抗原直接包被酶標(biāo)板,檢測(cè)經(jīng)臨床鑒定的EV71感染患兒陽性血清20份,陽性率85%,檢測(cè)柯薩奇病毒抗體陽性血清均為陰性; 4.反復(fù)篩選獲得2株穩(wěn)定分泌抗EV71單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株:EM1、EM2,經(jīng)過檢測(cè)腹水中抗體效價(jià)為10~(-4)。 結(jié)論 1. EV71病毒在RD細(xì)胞中能很好的增殖,通過病毒培養(yǎng)能提高標(biāo)本中EV71的核酸檢出率,標(biāo)本在病毒分離前后的RT-PCR結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ~2 =4.9,P0.05),成功分離到西安地區(qū)腸道病毒71型流行株; 2.建立了一種新的間接ELISA檢測(cè)方法,這種方法檢測(cè)血清中EV71抗體是特異的,提示純化抗原的免疫性好,為后面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提供可靠性; 3.獲得2株穩(wěn)定分泌抗EV71單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,并制備大量含特異性單克隆抗體的腹水,為進(jìn)一步研究EV71病毒結(jié)構(gòu)功能及早期診治奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖 1 EV71 病毒顆粒結(jié)構(gòu)EV71 病毒基因組為含有大約 7411 個(gè)核苷酸的單鏈 RNA，腺嘌呤核苷酸和尿嘧啶核苷酸豐富，在 3’末端有多聚腺苷酸（polyA）尾，而其 5’末端共價(jià)結(jié)合有一個(gè)小分子量的蛋白（VPg），從基因組的 5’末端至 3’末端依次排列著 746 個(gè)核苷酸的 5’-非編碼區(qū)（untranslation region，UTR）、編碼區(qū)1A（多肽 VP4）、1B（多肽 VP2）、1C（多肽 VP3）、1D（多肽 VP1）、2A（特異性蛋白酶）、2B、2C、3A、VPg（5’-末端結(jié)合蛋白）、3C（特異性蛋白酶）、3D（RNA 多聚酶組分）、3’末端非編碼區(qū)（83 個(gè)核苷酸）以及多聚核苷酸尾，在病毒 RNA 正鏈和負(fù)鏈 5’-末端和 3’-末端非編碼區(qū)中分別含有多肽翻譯的起始信號(hào)以及 RNA 合成起始信號(hào)，通過其酪氨酸殘基的羥基基團(tuán)，VPg 蛋白與 RNA5’-末端的 pUpU 形成磷酸二酯鍵，再進(jìn)一步與基因組RNA 結(jié)合[3]。5’-UTR 結(jié)構(gòu)還涉及病毒的宿主范圍和病毒的毒力等多個(gè)方面的功能，，但 3’-UTR 區(qū)和多聚腺苷酸尾的功能目前還不清楚，病毒的單鏈

圖1-2 RT-PCR產(chǎn)物電泳圖為DNA Marker；1.咽試子標(biāo)本；2、3病毒培養(yǎng)上清；性對(duì)照；5.陽性對(duì)照標(biāo)本在病毒分離前與分離后RT-PCR結(jié)果比較T-PCR分離后RT-PCR陽性 陰性 總 6 1 9 6 15 7 測(cè)定結(jié)果因序列同GENEBAND 報(bào)道的西安地區(qū)EV71流行M 1 2 3 4 5
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R725.1

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