【摘要】：背景： 兒童心力衰竭是嚴重威脅小兒健康的世界性難題。在嬰兒期間,心臟發(fā)育的特點是快速生長和生理性重構(gòu)。出生后各種原因引起的心臟生長和重構(gòu)異常導(dǎo)致心臟發(fā)育異常,最終發(fā)展成心力衰竭。蛋白激酶B (protein kinase B, PKB/Akt)信號通路調(diào)控出生后心臟生長,Akt通過激活下游哺乳動物雷帕霉素靶點蛋白復(fù)合物1(mammalian target of rapamycin complex1, mTORC1)控制蛋白質(zhì)合成、能量代謝、凋亡和自噬等重要生命過程。腦組織富含的Ras同源物1(ras homologue enriched in brain, Rheb1)是mTORC1上游分子,屬于小GTP酶Ras超家族成員。以往主要研究了Rheb1在成年大鼠和小鼠心肌細胞中的作用。如Rheb1通過激活mTORC1信號通路調(diào)控成年大鼠心肌細胞生理性肥厚過程。我們課題組前期研究表明,Rheb1通過mTORC1信號通路調(diào)控成年小鼠心臟病理性重構(gòu)。關(guān)于Rheb1在出生后(幼年)心臟生長中的作用尚不清楚。 目的： 探究Rheb1在小鼠出生后心臟生長及生理性重構(gòu)中的作用。 方法： 通過心臟特異性基因敲除方法,在小鼠出生后心肌細胞中敲除Rheb1。通過大體形態(tài)、組織切片、特殊染色和電鏡,觀察Rheb1心肌特異性敲除小鼠心臟結(jié)構(gòu)的變化,同時測量Rheb1敲除小鼠的重要生理參數(shù)體重、心重和心重體重比。通過離體心臟灌流的方法分離心肌細胞,觀察Rheb1心肌特異性敲除小鼠心肌細胞形態(tài)學(xué)變化。通過心臟超聲和心電圖觀察Rheb1敲除對小鼠心臟功能和電活動的影響。通過蛋白印跡(western blot)、實時定量熒光聚合酶鏈反應(yīng)(real time quantitative polymerase chain reaction, qPCR)和免疫熒光方法檢測mTORC1信號通路、Akt信號通路、自噬和凋亡標記物和代謝相關(guān)基因的變化,對Rheb1敲除相關(guān)表型的分子機制進行研究。最后通過進一步敲除磷酸酶張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog, Pten)和Aktl改變Akt活性,觀察改變Akt活性變化對Rheb1敲除小鼠存活的影響。 結(jié)果： 各種基因型小鼠出生比例符合孟德爾遺傳學(xué)規(guī)律。Rheb1基因在出生后第三天部分敲除,第五至七天完全敲除。Western blot檢測提示,Rheb1蛋白水平在出生后第七天較對照組顯著下降。Rheb1敲除小鼠出生后第11天開始死亡,第16天全部死亡,中位生存時間12.5天。正常小鼠心臟重量和心肌細胞面積隨時間而增加,Rheb1敲除小鼠心臟重量和心肌細胞面積第九天開始停止增加,心重體重比顯著低于對照組。麥胚凝集素(wheat germ agglutinin, WGA)染色示Rheb1敲除小鼠出生后第9天心肌細胞數(shù)目較對照組顯著減少。Rheb1敲除組小鼠體重于死亡前1-2天下降并顯著低于對照組。與正常對照組小鼠比較,Rhebl敲除小鼠第十天出現(xiàn)左室射血分數(shù)顯著下降和惡性心律失常,左室舒張末內(nèi)徑第12天顯著增大。電鏡檢測發(fā)現(xiàn)Rheb1敲除小鼠心肌線粒體較對照組顯著受損�！甌UNEL和凋亡標記物檢測發(fā)現(xiàn)Rheb1敲除小鼠心肌細胞凋亡較對照組顯著增加。與對照組相比,Rheb1敲除組自噬標記物L(fēng)C3Ⅰ水平顯著降低,而LC3Ⅱ水平?jīng)]有相應(yīng)增加。Western blot和qPCR檢測顯示,與對照組相比,Rheb1敲除組mTORC1下游信號分子核糖體蛋白6(ribosomal protein6, S6)和真核細胞翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1(eukaryotic initiation factor4E binding protein1,4E-BP1)磷酸化水平顯著下降,代謝相關(guān)基因顯著下調(diào)。進一步凋亡相關(guān)信號分子檢測發(fā)現(xiàn),Rheb1敲除小鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標記物capspasel2、C/EBP同源物蛋白(C/EBP homologous protein, CHOP)、磷酸化c-Jun氮末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)、激活作用轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor6, ATF6)和剪切的X盒結(jié)合蛋白-1(spliced X-box binding protein-1, sXBP)較對照組顯著上調(diào)。與對照組相比,Rheb1敲除組Akt活性顯著增加。通過Rheb/Pten雙敲除提高Akt活性可以延長Rheb1敲除小鼠存活。 結(jié)論： Rheb1是小鼠出生后心臟mTORC1信號激活所必需,Rheb1通過激活mTORC1信號調(diào)控出生后心肌細胞生長、能量代謝、存活、心臟功能及電生理穩(wěn)態(tài)。在小鼠出生后心臟中,Rheb1-mTORC1信號和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)信號存在對話,調(diào)控出生后心肌細胞凋亡。Rheb1可能通過mTORC1依賴與非mTORC1依賴的方式調(diào)控出生后心肌細胞自噬。提高Akt活性有助于改善幼年心衰小鼠存活。
【圖文】：

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)信號通路洞亡示意圖

圖3-2 Rhebl-mTORCl信號與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激關(guān)系示意圖l 代表腦組織富含的 Ras 同源物 1 (Ras homologue enriched in brain 1), mTORCl 代表動物雷帕霉素作用IE點蛋白復(fù)合物1 (mammalian target of rapamycin complex 1), ER內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum)。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R725.4

【共引文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 伍寧波;蘇冰;;mTOR信號通路在CD4~+T細胞分化中的作用[J];現(xiàn)代免疫學(xué);2013年06期

2 陳銀濤;于秉治;武迪迪;;PI3K/Akt/mTOR信號通路及臨床相關(guān)腫瘤抑制劑[J];中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報;2014年10期

3 侯作旭;張圓;高峰;;有氧運動的心血管保護機制及其研究進展[J];生理科學(xué)進展;2014年04期

4 徐小紅,譚建新;心肌細胞凋亡信號通路及調(diào)節(jié)[J];右江民族醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2005年04期

5 于利;雋兆東;;Akt與心肌保護的研究進展及臨床啟示[J];醫(yī)學(xué)與哲學(xué)(臨床決策論壇版);2006年08期

6 吳紅金;劉宇娜;;人參皂甙Rg1抑制~(60)Co照射誘導(dǎo)心肌細胞凋亡[J];醫(yī)學(xué)綜述;2008年21期

7 李紀明;鄒云增;姚志峰;姜紅;關(guān)愛麗;吳劍;牛玉宏;弭守玲;梁艷艷;馬楨;;熱休克轉(zhuǎn)錄因子1對壓力超負荷引起的心室重構(gòu)和心力衰竭的影響[J];中國病理生理雜志;2008年03期

8 熊玉娟;胡朝暉;邱峰;劉本榮;;miR-29下調(diào)AKT信號通路中多個基因的表達[J];中華臨床醫(yī)師雜志(電子版);2012年14期

9 余洪松;凌琳;謝峻;姜宏;施廣飛;;丹參注射液對小鼠急性心肌梗死后心臟成體干細胞移植的影響[J];中國中西醫(yī)結(jié)合雜志;2013年11期

10 孫子林;;腸促胰素的心血管安全性再評價[J];藥品評價;2014年15期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 蘇慧;高血糖對缺血/再灌注心肌損傷和GIK心肌保護作用的影響及其機制[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2007年

2 張遠恒;GSK-3β抑制劑氯化鋰對缺血再灌注損傷大鼠心肌細胞凋亡及Bcl-2,Caspase-3表達的影響[D];華中科技大學(xué);2009年

3 屠恩遠;丹參酮ⅡA對肥厚心肌信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)蛋白激酶B通路的影響[D];華中科技大學(xué);2009年

4 邱婷婷;Rap1GAP對急性髓系白血病細胞生物學(xué)特性的影響及作用機理的研究[D];蘇州大學(xué);2013年

5 劉劍鋒;Exendin-4聯(lián)合脂肪來源干細胞移植治療急性心梗的作用及機制研究[D];中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院;2013年

6 張錚;7磷酸肌醇在糖尿病心肌缺血/再灌注損傷中的作用及機制研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2013年

7 馬愛平;Tsc1基因在小鼠血管發(fā)育和肺發(fā)育中的調(diào)控機制研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2013年

8 楊瓊;microRNA-21在大鼠心肌缺血再灌注早期的抗凋亡作用及機制[D];中南大學(xué);2013年

9 孫中嬋;NDRG2在心肌缺血再灌注損傷中Akt所介導(dǎo)的胰島素保護效應(yīng)中的作用研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2013年

10 張軍港;miR-148b對胰腺癌生物學(xué)行為的影響及機制研究[D];華中科技大學(xué);2013年

，

本文編號：2585641