發(fā)布時(shí)間：2020-01-23 11:58

【摘要】：背景：支氣管哮喘作為一種常見(jiàn)疾病，在兒童期間發(fā)病率在世界范圍內(nèi)有逐漸上升的趨勢(shì)。兒童哮喘與成人哮喘具有同樣的病理生理基礎(chǔ)，但由于兒童處于生長(zhǎng)發(fā)育階段，因此具有其自身的特點(diǎn)。小兒氣道炎癥也會(huì)隨年齡增長(zhǎng)而發(fā)生變化，最終約2/3患兒疾病自然緩解、癥狀消失，另外1/3左右患兒病情持續(xù)、發(fā)展為成人哮喘。兒童哮喘這種隨年齡變化而呈現(xiàn)的不同自然病程及預(yù)后轉(zhuǎn)歸現(xiàn)象目前都還沒(méi)有合理的解釋?zhuān)渥匀徊〕萄葑円?guī)律及機(jī)制還不清楚，然而疾病的自限性和進(jìn)展性的差異提示它們存在本質(zhì)上的不同。目前，臨床上通常以臨床癥狀、肺功能及治療效果來(lái)衡量哮喘輕重及控制情況，但絕大多數(shù)穩(wěn)定期哮喘患兒肺功能正常。研究表明即使部分患兒肺功能正常，其仍持續(xù)存在小氣道慢性炎癥，而該種慢性炎癥的持續(xù)存在是導(dǎo)致兒童哮喘反復(fù)發(fā)作和病情進(jìn)展導(dǎo)致控制不良的基礎(chǔ)。因而肺功能是評(píng)估兒童哮喘病情不夠敏感的指標(biāo)。早期明確哮喘患兒病情嚴(yán)重程度及其轉(zhuǎn)歸方向?qū)χ笇?dǎo)兒童哮喘治療和減輕家長(zhǎng)及患兒心理負(fù)擔(dān)有重要意義。但目前臨床上缺乏能夠準(zhǔn)確評(píng)估哮喘病情及預(yù)后的客觀指標(biāo)，更缺少針對(duì)兒童哮喘病情及預(yù)后評(píng)估的前瞻性的研究。疾病相關(guān)的生物靶標(biāo)（biomarker）可提示疾病相關(guān)信息，可用于疾病的輔助診斷、病情進(jìn)展的監(jiān)測(cè)和預(yù)后及疾病的預(yù)防。目前關(guān)于兒童哮喘的生物靶標(biāo)研究還很局限，因此，急需新興的生物靶標(biāo)來(lái)輔助客觀地評(píng)估兒童哮喘。蛋白質(zhì)組學(xué)的出現(xiàn)，為哮喘生物靶標(biāo)的篩選提供了新的希望。采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法篩選疾病相關(guān)的蛋白靶標(biāo)，可發(fā)現(xiàn)疾病相關(guān)的系列蛋白靶標(biāo)及潛在藥物靶標(biāo)，還可發(fā)現(xiàn)目前沒(méi)有同疾病相關(guān)聯(lián)的新蛋白。 目的：篩選潛在用于評(píng)估兒童哮喘病情及預(yù)后的蛋白靶標(biāo)。 方法：通過(guò)使用二維差異凝膠電泳技術(shù)（two dimensional differential in-gelelectrophoresis，2D-DIGE），分離及篩選不同輕重程度穩(wěn)定期哮喘兒童（根據(jù)GINA方案，間歇發(fā)作、輕度持續(xù)、中度持續(xù)、重度持續(xù)組）及健康兒童血漿蛋白，進(jìn)一步經(jīng)基質(zhì)輔助激光解吸/電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization-time offlight-mass spectrometry，MALDITOF/TOF MS）鑒定，然后經(jīng)ELISA方法進(jìn)行另一擴(kuò)大人群臨床驗(yàn)證試驗(yàn)，明確各蛋白靶標(biāo)在病情輕重不同組別的分布規(guī)律，篩選評(píng)估兒童哮喘病情輕重的蛋白靶標(biāo)（候選蛋白靶標(biāo)多組間比較統(tǒng)計(jì)分析采用單因素方差分析）；同時(shí)對(duì)哮喘兒童進(jìn)行為期3年的隊(duì)列研究，根據(jù)其轉(zhuǎn)歸情況（完全緩解、好轉(zhuǎn)、持續(xù)、進(jìn)展），再次行血ELISA靶標(biāo)檢測(cè)，分別分析入組初及3年隨訪后的個(gè)體候選靶標(biāo)表達(dá)水平及其隨訪前后的蛋白靶標(biāo)水平的差值，分別按照轉(zhuǎn)歸分組進(jìn)行多組間比較的單因素方差分析，篩選評(píng)估兒童哮喘預(yù)后的蛋白靶標(biāo)。 結(jié)果:通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)分析，組間共篩選出36個(gè)差異蛋白（p0.05），20個(gè)蛋白點(diǎn)經(jīng)質(zhì)譜鑒定，代表了8種蛋白（同種蛋白由于同型異構(gòu)體的分子量或等電點(diǎn)的不同可出現(xiàn)在凝膠的不同位置），其中4個(gè)蛋白靶標(biāo)經(jīng)擴(kuò)大人群ELISA試驗(yàn)驗(yàn)證，在組間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，分別為抗凝血酶III （antithrombin-III， AT-III）、 α2巨球蛋白（alpha2-macroglobulin，A2M）、CD5L（CD5antigen-like, CD5L）、補(bǔ)體C3（Complement3,C3）。在穩(wěn)定期兒童哮喘與對(duì)照組間比較，AT-III在哮喘組表達(dá)明顯高于對(duì)照組（p0.01）；C3、A2M在對(duì)照組高于哮喘組（p0.05）；在穩(wěn)定期哮喘組內(nèi)比較差異有顯著性，AT-III隨病情加重表達(dá)有升高趨勢(shì)（ANOVAp0.05），CD5L、A2M隨病情加重表達(dá)有逐漸下降的趨勢(shì)（ANOVA,p0.05, p0.01），其中AT-III與A2M呈負(fù)相關(guān)（r=-0.259，p0.05）,與CD5L呈負(fù)相關(guān)（r=-0.276，p0.05）,與FEV1%/FVC%呈負(fù)相關(guān)（-0.362，p0.05）；CD5L與A2M之間呈正相關(guān)（r=0.303, p0.01），與FEV1%/FVC%呈正相關(guān)（r=0.264，p0.05）。隊(duì)列研究中（3年隨訪前后）各轉(zhuǎn)歸組間比較，CD5L表達(dá)在入組時(shí)（CD5L前）各轉(zhuǎn)歸組間分布差別有顯著性（p0.05），隨轉(zhuǎn)歸加重其表達(dá)下降。在隨訪結(jié)束時(shí)（CD5L后）其表達(dá)在各轉(zhuǎn)歸組間分布差別有顯著性（p0.01），隨轉(zhuǎn)歸加重其表達(dá)下降。CD5L差值（CD5后－CD5前）在各轉(zhuǎn)歸組間分布差別有顯著性（p0.05），在加重及持續(xù)組其差值下降高于健康對(duì)照；AT-III前及AT-III后在各轉(zhuǎn)歸組間分布差別無(wú)顯著性，但其表達(dá)隨轉(zhuǎn)歸加重由升高趨勢(shì)。AT-III差值在各轉(zhuǎn)歸組間分布差別有顯著性（p0.05），在好轉(zhuǎn)組其差值降低高于持續(xù)、加重組及健康對(duì)照組；A2M前在各轉(zhuǎn)歸組間分布差別有顯著性（p0.05），健康對(duì)照組與完全緩解組及加重組間存在差異，A2M后在各轉(zhuǎn)歸組間分布差別無(wú)顯著性，A2M前及A2M后其表達(dá)隨轉(zhuǎn)歸變化無(wú)明顯趨勢(shì)。A2M差值在各轉(zhuǎn)歸組間分布差別無(wú)顯著性；補(bǔ)體C3前、補(bǔ)體C3后及補(bǔ)體C3差值在各轉(zhuǎn)歸組間分布差別皆無(wú)顯著性，其隨轉(zhuǎn)歸變化無(wú)明顯趨勢(shì)。 結(jié)論:本研究通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)方法發(fā)現(xiàn)了兒童哮喘評(píng)估病情及預(yù)后的相關(guān)系列蛋白靶標(biāo)。AT-III、A2M、補(bǔ)體C3可輔助診斷兒童哮喘；AT-III、A2M、CD5L與兒童哮喘疾病嚴(yán)重相關(guān)，AT-III、CD5L與兒童哮喘預(yù)后轉(zhuǎn)歸相關(guān)。血漿蛋白靶標(biāo)AT-III、A2M、CD5L、補(bǔ)體C3有望作為輔助兒童哮喘診斷及評(píng)估疾病嚴(yán)重程度及預(yù)后的有力工具。
【圖文】：

行 3 年的縱向隨訪（包括對(duì)其候選血漿蛋白靶標(biāo)的動(dòng)態(tài)檢測(cè)），針對(duì)哮喘歸類(lèi)型，分析其血漿標(biāo)志物表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化，來(lái)尋找與兒童哮喘疾病不同列蛋白靶標(biāo)。1）參選對(duì)象管理流程圖：究對(duì)象入組（納入及排除標(biāo)準(zhǔn)，簽署知情同意）--- 建立基本信息檔案 --檢查 --- 按 GINA 方案評(píng)估病情分組、治療 --- 門(mén)診隨訪（每 3 個(gè)月 1隨訪結(jié)束，重新評(píng)估病情分組，采血。2）蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)流程圖：漿標(biāo)本（包括穩(wěn)定期哮喘兒童間歇、輕度、中度、重度及健康對(duì)照，加酶存）--- 去除高豐度蛋白（IgY14 免疫親和柱）--- 除鹽，定量 --- 雙相凝蛋白篩選） --- 候選蛋白靶標(biāo) --- 質(zhì)譜分析（MALDI-TOF/TOF MSMS）體見(jiàn)圖 1.1。

、手工刪除非蛋白點(diǎn)，凝膠間蛋白點(diǎn)的匹配分析。通過(guò)進(jìn)行膠內(nèi)檢白點(diǎn)的數(shù)量（多數(shù)約 2000 個(gè)點(diǎn)左右）、定位及編號(hào)以及蛋白點(diǎn)的相動(dòng)或手動(dòng)執(zhí)行確定最佳靈敏度，（靈敏度過(guò)高會(huì)增加入選非蛋白點(diǎn)掉真正的蛋白點(diǎn)。）然后進(jìn)行消除背景，通過(guò)調(diào)節(jié)要消除背景的大空間分析范圍。然后進(jìn)行蛋白點(diǎn)歸一化處理，通過(guò)內(nèi)標(biāo)匹配的蛋白別蛋白點(diǎn)最多的膠為主膠（即 Master 膠），，進(jìn)而與其他凝膠圖像進(jìn)行手工刪除非典型蛋白點(diǎn)和雜質(zhì)造成的“假點(diǎn)”。接下來(lái)在 DeCyder-BV間匹配明確的蛋白點(diǎn)盡量先進(jìn)行人工匹配，然后啟動(dòng) BVA 軟件自動(dòng)膠與主膠之間的匹配。當(dāng)所有蛋白點(diǎn)匹配工作完成后，軟件可自動(dòng)達(dá)量的差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（t 檢驗(yàn)），通過(guò)設(shè)置有意義蛋白表達(dá)量會(huì)自動(dòng)提供出差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的蛋白點(diǎn)編號(hào)。PH4-7
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R725.6;R3411

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 陳育智;;兒童哮喘防治近況[J];華中醫(yī)學(xué)雜志;2006年04期

2 王好典;陳慧中;張?chǎng)?員聰敏;李克偉;陳晨;李俊玲;錢(qián)淵;;356例兒童支氣管哮喘5年隨訪觀察[J];臨床兒科雜志;2009年03期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 劉瑩;氧化應(yīng)激對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞作用的蛋白質(zhì)組學(xué)分析[D];吉林大學(xué);2012年

本文編號(hào)：2572271