【摘要】：研究背景：過敏性紫癜(Henoch-Sch(?)nlein purpura, HSP)是兒童期常見的全身性小血管炎性疾病,主要病理特點是以IgA為主的免疫復合物在微動脈、微靜脈、毛細血管壁和腎小球系膜區(qū)的沉積。臨床上主要表現(xiàn)為非血小板減少性的皮膚紫癜,關節(jié)痛、關節(jié)炎,腹痛、消化道出血,血尿、蛋白尿等,此外,還可能累計肺臟、肝臟、大腦和陰囊等。腸穿孔和中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累比較少見,但是HSP患者死亡的主要原因。HSP是一種特征性自限性疾病,但容易反復發(fā)作,影響其預后的主要因素是腎臟損傷程度,有的甚至發(fā)展為慢性腎功能衰竭。其病因及發(fā)病機制仍未完全明確,臨床上仍缺乏診斷HSP的特異性實驗室指標以及腎臟累及的早期預測指標,診斷一般根據(jù)臨床表現(xiàn)、體征和組織病理學檢查。研究表明,感染、藥物、疫苗、環(huán)境以及自身免疫功能紊亂都可能導致HSP的發(fā)病。因此,通常認為HSP是一種環(huán)境因素,尤其是感染因素作用于具有遺傳背景的個體,導致機體免疫應答異常,輔助性T淋巴細胞和B淋巴細胞活性增強,所引起的以IgA為主的免疫復合物所介導的系統(tǒng)性免疫性血管炎。該過程中,存在有細胞因子異常分泌,凝血和纖溶系統(tǒng)失調,炎性細胞浸潤,IgA和補體等免疫復合物的沉積等。進一步研究HSP發(fā)病機制,尋找其特異性實驗室診斷指標,早期預警腎臟累及,根治該疾病,是臨床和科研工作者面臨的重要任務。最近幾年,臨床和科研工作者結合臨床流行病資料,利用先進的分子生物學技術,從分子和基因水平進一步研究了HSP的發(fā)病機制,取得了一定的研究成果。但對于HSP患兒細胞因子表達水平和免疫功能等方面的研究結果并不一致,而且仍有許多問題有待進一步研究和解決。中期因子(midkine, MK)是上世紀80年代發(fā)現(xiàn)的一種新的胚胎發(fā)育相關分子,又稱為神經(jīng)軸突促進生長因子-2,與多向性因子(pleiotrophin, PTN)共同組成肝素結合生長因子家族。最初以為MK在成年生物體內(nèi)表達水平極低,并僅限于個別器官。但新近研究發(fā)現(xiàn),MK在許多腫瘤疾病(如Wilms瘤、胃癌、胰腺癌、肝細胞癌、食管癌、乳腺癌、白血病等)、慢性炎癥性疾病、自身免疫性疾病(如克羅恩病、類風濕性關節(jié)炎、慢性腎炎、多發(fā)性硬化等)和組織修復過程中存在過表達或高表達。并且具有促進腫瘤發(fā)生發(fā)展、侵襲、促進血管生成、促有絲分裂、抗凋亡、促進炎癥細胞趨化和纖維蛋白溶解等功能。同時,MK具有抗菌活性,能夠抑制調節(jié)性T細胞(T-regulatory cell, Treg),誘導炎性細胞因子表達。一系列研究證明,外周血MK有可能成為一個敏感且有意義的疾病標志物,尤其是腫瘤性疾病和自身免疫性疾病,且其表達水平與病情輕重、是否伴有并發(fā)癥以及預后緊密相關。本研究以檢測HSP患兒外周血MK的表達為基礎,探討HSP患兒急性期免疫功能狀態(tài)和細胞因子水平變化,為進一步明確HSP發(fā)病機制、尋找HSP特異性診斷指標奠定理論基礎。目的：本實驗旨在研究HSP患兒急性期外周血MK、免疫球蛋白、T細胞亞群和部分細胞因子的表達情況。分析MK與TNF、IFN-γ、IL-2、IL4、IL6、IL10和IL17A等細胞因子、免疫指標和實驗室檢查的相關性。探討MK對HSP患兒病情的診斷和指導作用,以及MK是否能夠早期預測HSP患兒的腎臟損害。同時,對腎臟累及組和無腎臟累及組HSP患兒補體、肌酐、尿素等生物學指標進行檢測并做統(tǒng)計學分析,以期尋找HSP患兒腎臟損害的早期預測指標。方法：收集2015年在山東大學齊魯兒童醫(yī)院腎臟與風濕免疫科住院治療的HSP患兒203例,從中選取符合入組標準的92例患兒進行研究。其中,紫癜性腎炎(Henoch-Sch(?)nlein purpura nephritis, HSPN)患兒36例,無腎臟損害HSP(HSP/no-nephritis)患兒56例。同時選取60名健康兒童為對照(normal controls, NC)。收集研究對象的空腹外周血,酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)檢測各組研究對象血清中MK的表達水平；微量樣本多重蛋白定量實驗(Cytometric Bead Array, CBA)檢測各組研究對象血清中TNF、IFN-γ、IL-2、IL4、IL6、IL10和IL17A的表達水平；免疫比濁法(Turbidimetric inhibition immuno assay)檢測患兒免疫球蛋白；流式細胞術檢測患兒T淋巴細胞亞群；并結合相關臨床實驗室檢查,如尿微量白蛋白、24小時尿蛋白定量、尿蛋白比肌酐、補體C3、補體C4、D二聚體等,初步分析MK在HSP急性期患兒疾病發(fā)生發(fā)展過程中的作用。數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析采用IBM SPSS 23.0軟件,雙側P0.05被認為具有統(tǒng)計學意義。對于連續(xù)性變量,根據(jù)數(shù)據(jù)特點采用T檢驗、方差分析檢驗、Kruskal-Wallis H檢驗、Mann-Whitney U檢驗；分類變量的比較采用χ2檢驗；各檢測指標之間的相關性分析采用Spearman相關分析,并采用多重相關分析的Bonferroni校正；MK對于HSP的診斷能力評估采用受試者工作特征(receiver operating characteristics, ROC)曲線分析。ROC曲線下面積(area under the curve, AUC)為1.0時表示完美的診斷價值,AUC小于0.5為無診斷價值,0.5-0.7為較低診斷價值,0.7-0.9為有一定診斷價值,0.9-1.0為較強診斷價值。另外,計算其敏感度(sensitivity)、特異度(specificity)、臨界濃度(cutoff concentration)和置信區(qū)間(confidence interval, CI)。結果：1、92例HSP患兒中,男孩56例(60.87%),女孩36例(39.13%)年齡6.76±2.04歲；60例NC組兒童中,男孩42例(70%),女孩18例(30%),年齡7.01±1.79歲。病例組與健康對照組兒童在性別和年齡組成上無統(tǒng)計學差異(P0.05)。92例患兒中,HSP/no-nephritis患兒56例,男孩32例(57.14%),女孩24例(42.86%),年齡6.46±2.12歲；HSPN患兒36例,男孩24例(66.67%),女孩12例(33.33%),年齡7.22±1.83歲。三組兒童在性別和年齡組成上也無統(tǒng)計學差異(P0.05)。其中,臨床表現(xiàn)為單純皮疹型的14例,男孩7例(50%),女孩7例(50%)；腹型15例,男孩9例(60%),女孩6例(40%)；關節(jié)型24例,男孩14例(58.33%),女孩10例(41.67%)；腎型13例,男孩11例(84.62%),女孩2例(15.38%)；混合型26例,男孩15例(57.69%),女孩11例(42.31%)2、HSP患兒外周血MK濃度為291.74 (248.56-396.42) pg/ml,明顯高于健康對照組217.3 (198.98-243.65) pg/ml,(P0.05)。其中,HSPN組MK濃度為326.58 (266.58-459.25) pg/ml, HSP/no-nephritis組為280.72(233.67-384.36) pg/ml,均顯著高于健康對照組(P0.05),而且,HSPN組MK濃度也高于HSP/no-nephritis組(P0.05)。3、HSP患兒外周血TNF、IFN-γ、IL4、IL6、和IL17A表達較健康對照組升高,IL10較健康對照組降低,而IL-2水平與健康對照組相比無差異。HSP/no-nephritis組與HSPN組患兒血清中以上檢測的細胞因子水平均無統(tǒng)計學差異。4、HSP急性期患兒免疫功能各檢測指標結果的統(tǒng)計學分析。(1)T淋巴細胞亞群分析：與健康對照組相比,HSP患兒外周血CD4+T淋巴細胞百分率和CD4+/CD8+比值下降(P0.01),CD8+T淋巴細胞百分率無統(tǒng)計學差異(P0.05)；CD4+、CD8+百分率以及CD4+/CD8+比值在HSPN組和HSP/no-nephritis組無統(tǒng)計學差異(P均0.05)。(2)免疫球蛋白分析：與健康對照組相比,HSP患兒外周血IgA、IgM、 IgE水平顯著升高(P0.01),而IgG水平無明顯差異(P0.05);IgA、 IgM、IgE水平在HSPN組和HSP/no-nephritis組無統(tǒng)計學差異(P均0.05),而IgG水平在HSPN組低于HSP/no-nephritis組(P=0.04)。(3)其他實驗室檢測指標：與健康對照組相比,HSP患兒外周血D二聚體水平顯著升高(P=0.002),纖維蛋白原也顯著增高(P0.01)。補體C3、補體C4、血尿素氮和血肌酐水平無統(tǒng)計學差異(P均0.05)；D二聚體、補體C3、補體C4、血尿素氮和血肌酐水平在HSPN組和HSP/no-nephritis組無統(tǒng)計學差異(P均0.05),HSPN組纖維蛋白原也高于HSP/no-nephritis組(P=0.02)。5、外周血MK濃度與HSP患兒臨床特點的相關性分析。相關分析結果示：外周血MK與IL-4、IL-6,、L17A、IgA和IgE呈正相關；HSPN亞組,外周血MK與HSPN患兒血肌酐、尿微量白蛋白、24小時尿蛋白定量和尿蛋白比肌酐呈正相關。6、血清MK ROC曲線下面積是0.902,95%置信區(qū)間為0.841-0.963(P0.001)。外周血清MK對HSPN的診斷最佳臨界值是295.58pg/ml,其敏感度為80.6%,特異性為88.3%。即當外周血清MK濃度大于295.58pg/ml時,HSP患兒可能出現(xiàn)腎臟累及。結論：1、MK在過敏性紫癜患兒,尤其是紫癜性腎炎患兒外周血中明顯升高。2、進一步證實過敏性紫癜急性期患兒體內(nèi)存在細胞免疫和體液免疫功能紊亂,以及炎癥細胞因子分泌的紊亂和凝血功能紊亂。3、過敏性紫癜患兒外周血升高的MK與機體內(nèi)IL-4、IL-6、L17A、IgA和IgE水平呈正相關,而且在HSPN患兒,MK與血肌酐、尿微量白蛋白、24小時尿蛋白定量和尿蛋白比肌酐呈正相關。4、本研究提示,MK在HSP的發(fā)病中可能具有重要作用,尤其是在紫癜腎的發(fā)生發(fā)展過程中。MK不僅有望成為HSP診斷的生物學指標,而且有可能是HSP患兒合并HSPN的早期預測指標。
【圖文】：

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【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R725.5

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本文編號：2571587