【摘要】：支氣管肺發(fā)育不良(Bronchopulmonary dysplasia, BPD)是早產(chǎn)兒高氧、機械通氣治療的常見并發(fā)癥,病因尚不明確。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endolasmic reticulum sress, ERS)與很多疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關,而ERS與高氧性肺損傷的關系日益受到關注。研究表明,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過氧化可影響蛋白質(zhì)的正確折疊,導致未折疊蛋白反應(unfolded protein response, UPR),UPR經(jīng)其膜上的PERK、IRE1及ATF6等3個跨膜蛋白轉(zhuǎn)導應激信號而發(fā)生反應,但是BPD中其作用機制尚不清楚。IGF-1作為體內(nèi)重要的生長因子對組織細胞的增殖、分化、凋亡,機體的生長發(fā)育中起重要的調(diào)節(jié)作用。其作用機制是促進細胞DNA合成和代謝,促使細胞進入G1期,從而有利于細胞增殖,同時通過PI3K/Akt和MAPK信號途徑的交叉作用抑制各種細胞凋亡。因此,本課題利用高氧性肺損傷新生大鼠模型探討ERS及UPR信號通路在BPD中的作用及靶點；在此基礎上,進一步闡明外源性IGF-1保護高氧性肺損傷中對ERS反應性信號靶點的干預作用。這將有效揭示ERS途徑在高氧性BPD中的作用及分子機制,也為IGF-1防治BPD的臨床應用提供科學的理論依據(jù)。第一部分ERS在高氧性肺損傷中的作用目的：探討ERS信號途徑在高氧引起的新生大鼠肺損傷中的變化及其分子機制。方法：利用足月新生Wistar大鼠制備高氧性肺損傷模型,模型制作后1.3.7.14天不同時間檢測大鼠肺組織肺干濕重比；取BALF行Diff-quik染色,檢測白細胞數(shù)；HE染色觀察肺肺泡發(fā)育和損傷程度,電鏡觀察肺上皮細胞超微結(jié)構(gòu)的變化,核染色結(jié)合TUNEL法觀察肺細胞凋亡；利用western blotting方法檢測Bcl2/BaX、Bip/GRP78、CHOP/GADD153、caspase-12表達水平。結(jié)果：1.高氧組與空氣對照組比較高氧3天、7天、14天肺濕/干比重(W/D)明顯增加有統(tǒng)計學意義,高氧1天組無明顯變化。2.高氧新生大鼠BALF中高氧1天、3天、7天時白細胞數(shù)高于正常組。模型組1、3、7天隨著高氧時間延長細胞數(shù)增多,Diff-quik染色結(jié)果：高氧組BALF中分泌物增多,炎性細胞增多,隨著高氧時間延長炎性細胞浸潤增加。3.HE染色結(jié)果高氧3天可見炎細胞滲出,7天肺泡減少,炎細胞進一步增多、14天出現(xiàn)肺纖維化。4.透射電鏡結(jié)果高氧組板層小體數(shù)量增多,隨著高氧時間延長排空狀態(tài)增多,核濃縮邊集,Ⅱ型肺泡上皮細胞內(nèi)空泡形成。5.TUNEL染色測定肺細胞凋亡,高氧3天(5.6±0.8)、7天(6.3±0.7)、14天(6.4±0.1)與正常對照組3天(4.1±1.1)、7天(4.2±0.9)、14天(4.5±0.7)對比肺細胞凋亡指數(shù)明顯增高,有統(tǒng)計學意義；顯微鏡下觀察高氧3天、7天、14天肺細胞凋亡明顯增多,有統(tǒng)計學意義。6.Westernblot結(jié)果,高氧3天時模型組BaX蛋白表達高于對照組,隨著高氧時間延長BaX蛋白表達逐漸增高,高氧3天時模型組Bcl2蛋白表達低于對照組,隨著高氧時間延長Bcl2逐漸降低,Bcl2/BaX比值高氧3天時高氧組低于對照組,隨著高氧時間延長Bcl2/BaX比值降低：高氧組Bip/GRP78、CHOP/GADD153、caspase-12蛋白表達上調(diào),隨著高氧時間延長蛋白含量增高,高氧1天時無明顯變化。結(jié)論：1.高濃度氧可誘發(fā)肺水腫、炎癥反應,導致肺泡間隔增寬,Ⅱ型肺泡上皮細胞內(nèi)板層小體數(shù)量增加,空泡增多。2.ERS參與高氧誘導的肺細胞凋亡。第二部分 IGF-1保護高氧性肺損傷的作用及對ERS信號-靶點的影響目的：觀察IGF-1對高氧性肺損傷的保護作用,并探討其通過ERS信號靶點保護高氧性肺損傷的分子機制。方法：選擇Wistar新生大鼠建立新生大鼠高氧模型后,分為3組①空氣組,②高氧組(85%O2),③高氧+IGF-1組。治療組腹腔注射IGF-1,不同時間檢測大鼠肺組織肺干濕重比；取BALF行Diff-quik染色,檢測白細胞數(shù)；HE染色觀察肺泡發(fā)育和損傷程度,核染色結(jié)合TUNEL法觀察肺細胞凋亡；利用westernblot方法檢測肺組織caspase-12、JNK、p-JNK。 CHOP表達水平。結(jié)果：1.高氧+IGF-1治療組高氧3、7、14天時肺W/D比值比高氧同一天模型組降低,有統(tǒng)計學意義,而高氧一天組無明顯變化。同一天高氧組與空氣對照組對比(3、7、14天)W/D比值增加有顯著性差異,高氧+IGF-1組與高氧組對比W/D比值減少有顯著性差異,同一組與高氧1天組相比高氧3天、7天、14天組W／D比值增加,有顯著性差異；高氧+IGF-1組與高氧組對比W／D比值減少,有顯著性差異,同一組與高氧3天組相比高氧7天、14天組W／D比值增加,有顯著性差異。2.高氧1、3、7天、14天時IGF-1治療組BALF中白細胞數(shù)比高氧組明顯降低,有顯著性差異。Diff-quik染色結(jié)果：IGF-1組比高氧組炎細胞浸潤明顯減少。3.模型組,高氧3天(5.3±0.7)、高氧7天(5.4±0.7)、高氧14天(6.2±0.3)時與同一天正常對照組正常3天(4.2±0.9),正常7天(4.3±0.8),正常14天(4.5±0.7),對比肺細胞凋亡指數(shù)明顯增高,有顯著性差異,而高-+IGF-1治療組3天(4.6±0.7)、7天(5.0±0.7)、14天(5.1--±0.3)時細胞凋亡指數(shù)明顯降低,有統(tǒng)計學意義。IGF-1治療組3、7、14天時TUNEL染色凋亡細胞數(shù)比同一天模型組對比明顯減少有統(tǒng)計學意義。4.采用westernblotting方法測定蛋白結(jié)果高氧模型組3、7、14天時caspase-12N、JNK、 pJNK、CHOP蛋白含量明顯增高,而IGF-1治療組上述蛋白含量與同一天模型組對比明顯減少,說明IGF-1能抑制其蛋白表達水平。結(jié)論：1.IGF-1能減輕高氧肺水腫及炎癥反應,能抑制高氧肺細胞凋亡。2.IGF-1對高氧肺損傷保護作用與下調(diào)ERS相關的caspase-12、JNK、pJNK、CHOP蛋白表達有關。IGF-1可能通過ERS及JNK信號通路對高氧肺損傷起保護作用。
【學位授予單位】：延邊大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R722.6

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