【摘要】：研究背景:嬰幼兒血管瘤(Infantile hemangioma,IH)是嬰幼兒最常見的良性腫瘤。新生兒發(fā)病率高達(dá)10-12%,約60%的病變發(fā)生于頭頸部,嚴(yán)重者可影響患兒容貌、受累器官功能、心理健康等。若不加以干涉治療,大多數(shù)IH患者在一歲內(nèi)快速增長,之后在童年時慢慢退化為纖維脂肪組織。但約10%的IH由于其生長過于迅速、面積過大或者生長部位特殊,可能導(dǎo)致毀容、畸形、功能障礙甚至危及生命等。但目前IH特征性增殖、消退機(jī)制尚未闡明,致使其臨床治療效果也不甚滿意。目前關(guān)于IH的發(fā)生機(jī)制的探討,主要集中于血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的起源方面,其主要假說有:遺傳和基因突變學(xué)說、胎盤絨毛膜內(nèi)皮細(xì)胞學(xué)說、干細(xì)胞學(xué)說等,但目前仍未有一種學(xué)說能夠很好闡明IH早期過度增生與后期自行消退的臨床特征。以往認(rèn)為IH是始動于血管內(nèi)皮細(xì)胞,但2008年Khan等首次報道從IH組織中提取出血管瘤干細(xì)胞后,證實IH中存在干細(xì)胞。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),剛分娩出的嬰幼兒若發(fā)現(xiàn)存在血管瘤,立即取嬰幼兒血管瘤的胎盤組織(IHP),實驗發(fā)現(xiàn)組織中存在內(nèi)皮祖細(xì)胞,HE染色結(jié)果顯示,增生期IH與IHP的病理學(xué)組織形態(tài)相類似,而消退期IH組織中,未見內(nèi)皮祖細(xì)胞的表達(dá)。血管內(nèi)皮祖細(xì)胞是干細(xì)胞的一種,能夠定向分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞,同時具有自我更新、無限增殖、多向分化的能力,與增生期血管瘤臨床表現(xiàn)相似。綜上所述,本課題推測:嬰幼兒血管瘤的血管增生,是血管內(nèi)皮祖細(xì)胞通過胎盤組織,動員、遷移、定植并異常聚居于胚胎期的胎兒某個部位,在嬰兒出生后,由于胎盤產(chǎn)生的生長抑制因子被解除,在雌激素、各種細(xì)胞因子、特別是內(nèi)環(huán)境改變等因素的作用下,選擇性激活內(nèi)皮祖細(xì)胞,激活的內(nèi)皮祖細(xì)胞出現(xiàn)增殖,其絲足沿著促血管生長因子分泌充足的地方遷移,形成血管分支,芽生的血管側(cè)枝吻合形成血管叢,導(dǎo)致血管瘤增生期,血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞大量增殖、血管快速新生(出生~1歲左右);隨后在一系列信號通路的調(diào)控下,h EPCs逐漸分化為內(nèi)皮細(xì)胞后其自身表達(dá)逐漸減少,IH進(jìn)入相對靜止期(1歲后),之后嬰幼兒體內(nèi)微環(huán)境的改變導(dǎo)致血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞逐漸被纖維結(jié)締組織及脂肪組織所取代,從而產(chǎn)生特異性的消退期(5~10歲);我們認(rèn)為這種推測血管瘤的發(fā)生、發(fā)展、消退符合IH臨床表現(xiàn),解釋較為合理。目前認(rèn)為內(nèi)皮細(xì)胞過度增殖,血管迅速生長是IH病理組織學(xué)的最大特點。新生血管的生長和發(fā)育是由一系列血管生長因子通過許多信號通路完成的。傳統(tǒng)的觀點認(rèn)為血管形成只存在于成體,而血管生成僅限于胚胎。隨著h EPCs在成體的分離成功,證明血管生成也發(fā)生于成體。因此,血管形成、血管生成可能是人類血管新生的基本過程。h EPCs是內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞,在形態(tài)學(xué)無法將h EPCs與其他細(xì)胞區(qū)分開來,所以主要靠分子標(biāo)志識別。目前共識,CD34、CD133共同標(biāo)記的即為h EPCs。那么,各種細(xì)胞因子、內(nèi)環(huán)境信號改變是如何來調(diào)控血管瘤的發(fā)生與發(fā)展的呢?目前,在其他腫瘤的研究中也發(fā)現(xiàn),血管內(nèi)皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞分泌的促血管生成因子和抑血管生成因子,共同調(diào)控血管的發(fā)生與血管的形成。血管的新生是由于血管內(nèi)皮細(xì)胞在血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)等許多細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下,發(fā)生遷移和增殖,導(dǎo)致血管大量增生。VEGF是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的促血管生成因子,是新生血管形成過程中的中心調(diào)控因子及血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性的有絲分裂原,多種腫瘤動物模型研究已證實阻斷VEGF信號通路能夠降低腫瘤微血管密度,從而抑制腫瘤的生長。有研究顯示DLL4/Notch信號通路過度表達(dá),可產(chǎn)生非功能性血管,管腔纖細(xì),血流明顯減少,導(dǎo)致腫瘤缺血、缺氧,從而抑制腫瘤增生。VEGF可誘導(dǎo)DLL4表達(dá),激活DLL4/Notch信號通路,提示VEGF對DLL4/Notch信號通路有正調(diào)節(jié)作用。而此信號通路的活化可減弱內(nèi)皮細(xì)胞對VEGF誘導(dǎo)的血管新生反應(yīng),提示其可能會反饋抑制VEGF信號通路的功能活性。因此,只有在VEGF和DLL4/Notch信號通路的協(xié)調(diào)作用下,血管瘤血管新生才能有序進(jìn)行。目的為進(jìn)一步研究證實上述猜想,本研究擬1、在IH不同時期及IHP中,檢測CD34/CD133染標(biāo)記的h EPCs的表達(dá)水平,證實增生期及IHP組織中h EPCs呈顯著性高表達(dá),而消退期低表達(dá)或不表達(dá),從而證實h EPCs與IH的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),驗證我們的推測,胎盤源性h EPCs始動IH的發(fā)生發(fā)展。2、在IH不同時期,免疫組織化學(xué)法檢測CD34、CD133、VEGF、DLL4的表達(dá)水平,探討VEGF-DLL4/Notch信號通路參與調(diào)控嬰幼兒血管瘤的血管新生。方法:1、收集廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院病理科2014-2017年嬰幼兒血管瘤存檔蠟塊50例其中男22例,女28例,年齡1月~2歲、平均1.2歲,患者術(shù)前均未做任何輔助性治療。將所有標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)HE染色,免疫組織化學(xué)SP法檢測增殖細(xì)胞核抗原(PCNA),按Mulliken分類標(biāo)準(zhǔn)并結(jié)合PCNA的表達(dá)進(jìn)行分組:石蠟標(biāo)本中增生期血管瘤26例,消退期血管瘤24例。應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法檢測IH增生期、消退期組織中第Ⅷ因子相關(guān)抗原(FⅧRAg)、VEGF、DLL4及CD34的表達(dá)水平。采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文報告管理系統(tǒng)對VEGF和DLL4的表達(dá)進(jìn)行定量分析,并測定每個視野下陽性反應(yīng)的平均光密度、陽性反應(yīng)面積和所有細(xì)胞總面積。為下一步實驗提供依據(jù)。2、收集廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院婦產(chǎn)科2014-2017年出生后發(fā)現(xiàn)疑似血管瘤的新生兒,在產(chǎn)婦胎盤娩出30分鐘內(nèi),在無菌操作下,切取胎盤葉狀絨毛膜部分。取材15例,常規(guī)HE染色后,鑒定符合嬰幼兒IHP者5例,例其中男3例,女2例,經(jīng)家屬同意后取正常胎盤組織5例,作為陰性對照組。用免疫組化及免疫熒光法鑒定IHP及增生期IH組織中存在h EPCs,同時檢測CD34、CD133、DLL4的表達(dá)水平。結(jié)果:1、通過免疫組化實驗結(jié)果顯示:嬰幼兒血管瘤增生期組VEGF、DLL4、CD34的表達(dá)明顯高于消退期組和正常皮膚組(P0.05),而后兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。VEGF表達(dá)陽性血管瘤的MVD為37.6±1.6,VEGF表達(dá)陰性血管瘤的MVD為16.4±2.0,兩者差異具有顯著性差異(t=4.87,P0.01)。VEGF和DLL4陽性面積率的相關(guān)性分析顯示,VEGF和DLL4在增生期及消退期IH組織中的表達(dá)均呈正相關(guān),r=0.821,P=0.003;DLL4:r=0.830,P=0.003。在IHP組織中,CD34,CD133以及DLL4主要定位于葉狀絨毛膜內(nèi)側(cè),陽性結(jié)果呈現(xiàn)彌漫分布的棕黃色顆粒,CD34,CD133及DLL4表達(dá)顯著。CD34,CD133及DLL4陽性率與陰性率相比,差異具有顯著性意義(P均0.01)。免疫熒光法鑒定時,CD34熒光染色時呈綠光,CD133呈紅光,雙染色顯著時呈黃色或黃綠色熒光,核染DAPI呈藍(lán)色,進(jìn)一步證實上述實驗結(jié)果。結(jié)論:1.CD34、CD133、DLL4及CD34、CD133共同染色標(biāo)記的內(nèi)皮祖細(xì)胞在嬰幼兒血管瘤增生期及IHP組織中高表達(dá),消退期及正常胎盤組織中低表達(dá)或不表達(dá),提示內(nèi)皮祖細(xì)胞在嬰幼兒的發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要角色。2.VEGF、DLL4、CD34、在嬰幼兒血管瘤增生期組織中呈高表達(dá),而在消退期低表達(dá)或不表達(dá),并存在顯著性差異,提示VEGF-DLL4/Notch信號通路參與調(diào)控嬰幼兒血管瘤的發(fā)生發(fā)展。
【圖文】：

圖 2c 圖 2d1.2 免疫組織化學(xué)法檢測 CD34，CD133 和 DLL4 在 IHP 組織中的表達(dá)IHP 組織中 CD34，CD133 和 DLL4 陽性染色主要在細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞胞膜內(nèi)側(cè)彌漫分布棕黃色顆粒，并且表達(dá)顯著（圖 3a-3c）。陰性對照組中上述因子弱表達(dá)或幾乎無表達(dá)（圖 7d）。上述因子陽性率與陰性率相比，差異具有顯著性意義（P 均 <0.01）圖 3a 圖 3b

圖 4c 圖 4d1.4 免疫熒光法檢測 CD34，CD133 及雙染色在 IHP 組織中的表達(dá)CD34 熒光染色時呈綠光，CD133 呈紅光，雙染色顯著時呈黃色或黃綠色熒光，核染 DAPI 呈藍(lán)色。在 IHP 組織中 CD34 顯著表達(dá)（圖 5a），CD133 高表達(dá)（圖 5bCD34/CD133 共同染色高表達(dá)（圖 5c，，DAPI 核染圖 5d）。在 IHP 組織中 CD34 顯著高表達(dá)，而 CD133 高表達(dá)。
【學(xué)位授予單位】：廣州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R732.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2554847