【摘要】：研究背景 急性胃腸炎是影響人群公共健康的重要疾病之一。經(jīng)過(guò)去20多年的研究發(fā)現(xiàn),病毒已經(jīng)取代細(xì)菌成為引起急性胃腸炎最重要的病原體,其中最常見(jiàn)的是輪狀病毒和諾如病毒。 諾如病毒,又稱(chēng)為諾瓦克樣病毒,是第一個(gè)被確認(rèn)的能夠引起急性胃腸炎的病毒。它可以感染任何年齡段的人群,而且由于其具有能夠在宿主體外長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定存活、引起感染只需要很低的病毒載量、感染后缺乏長(zhǎng)期免疫以及基因組常發(fā)生變異、重組等特點(diǎn),導(dǎo)致諾如病毒感染極易在散發(fā)基礎(chǔ)上出現(xiàn)暴發(fā)流行,因此也被稱(chēng)為“胃腸流感”。雖然我國(guó)早在1995年就有了諾如病毒感染的病例報(bào)道,但由于缺乏快速、敏感的檢測(cè)方法,而且未將諾如病毒感染列入醫(yī)院常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目,致使諾如病毒感染的分子流行病學(xué)特征和臨床表現(xiàn)的相關(guān)資料不足,嚴(yán)重阻礙了諾如病毒感染的防治進(jìn)展。 輪狀病毒被認(rèn)為是引起兒童急性胃腸炎最重要的病原體,尤其是5歲以下年齡的兒童,在這一年齡段至少會(huì)經(jīng)歷過(guò)一次輪狀病毒的感染。美國(guó)國(guó)家疾病預(yù)防與控制中心的報(bào)告指出,每年輪狀病毒感染在全球范圍內(nèi)可以引起2500萬(wàn)患兒就診,200萬(wàn)患兒住院治療,將近60萬(wàn)患兒死亡,因此輪狀病毒感染受到各國(guó)和地區(qū)的重視。但在臨床治療中發(fā)現(xiàn)并沒(méi)有針對(duì)輪狀感染的特效藥物,從而將對(duì)輪狀病毒感染的控制寄希望于高效價(jià)疫苗的研制與應(yīng)用。諾如病毒是僅次于輪狀病毒引起5歲以下兒童急性胃腸炎的常見(jiàn)病原體,雖然每年至多會(huì)引起20萬(wàn)患兒死亡而且引起的臨床癥狀較輕,但由于一直沒(méi)有研制出疫苗用來(lái)進(jìn)行預(yù)防,因此諾如病毒的感染亦不容忽視。如果能在臨床診斷與治療中將二者感染進(jìn)行鑒別,將會(huì)有效避免感染的大范圍傳播與流行。 本研究主要分為兩個(gè)部分：第一部分主要研究濟(jì)南地區(qū)成人諾如病毒感染的分子流行病學(xué)特征與臨床特征；第二部分主要研究濟(jì)南地區(qū)5歲以下兒童輪狀病毒與諾如病毒感染的分子流行病學(xué)特征以及二者感染特征的比較。旨在提供真實(shí)可靠的諾如病毒與輪狀病毒感染的流行病學(xué)特征和臨床表現(xiàn)資料,為疫苗的研制提供科學(xué)的依據(jù),為疾病的防治提供幫助。 第一部分 濟(jì)南成人急性胃腸炎患者諾如病毒感染的臨床與分子流行病學(xué)特征研究 目的： 1.研究濟(jì)南地區(qū)成人急性胃腸炎患者中諾如病毒的感染情況、流行特征及臨床表現(xiàn)。 2.研究濟(jì)南地區(qū)成人諾如病毒感染患者中是否存在重組諾如病毒株。 方法： 1.自2010年6月至2011年5月,在山東大學(xué)齊魯醫(yī)院感染病科胃腸道門(mén)診收集480例成人急性胃腸炎患者的臨床資料及糞便標(biāo)本。標(biāo)本采集后立即混懸離心,提取上清液保存于-70℃直至用于提取病毒RNA。 2.提取每例糞便標(biāo)本中的病毒RNA,提取后立即用經(jīng)滅活RNA酶處理的超純水進(jìn)行稀釋,分裝后保存于-700C待用。 3.采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)的方法對(duì)提取的病毒RNA進(jìn)行擴(kuò)增。為檢測(cè)是否存在變異重組諾如病毒株,每例病毒RNA標(biāo)本均采用兩種針對(duì)基因組不同編碼序列區(qū)段的引物進(jìn)行擴(kuò)增。 4.對(duì)擴(kuò)增出來(lái)的核酸物質(zhì)進(jìn)行純化,然后測(cè)定其序列。所有核酸序列應(yīng)用BLAST程序同NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中保存的諾如病毒株序列進(jìn)行比對(duì),然后采用Clustal X與MEGA程序進(jìn)行多序列比對(duì)和構(gòu)建進(jìn)化樹(shù),進(jìn)行流行基因型的分析。 5.對(duì)具有變異重組可能的病毒株RNA進(jìn)行跨區(qū)域核酸序列擴(kuò)增,擴(kuò)增后提純并測(cè)序,然后應(yīng)用Simplot軟件進(jìn)行重組分析。 結(jié)果： 1.在收集到的480例糞便標(biāo)本中,42例被檢測(cè)出諾如病毒陽(yáng)性,陽(yáng)性率為8.75%。 2.檢測(cè)到的諾如病毒株主要有7個(gè)基因型,GⅠ-1,GⅠ-4,GⅡ-1,GⅡ-3,GⅡ-4,GⅡ-6和GⅡ-13。其中最為流行的優(yōu)勢(shì)基因型為GⅡ-4(29/42,69.0%)。 3.諾如病毒感染患者的臨床表現(xiàn)主要為腹瀉(97.6%)、腹痛(40.5%)、發(fā)熱(28.6%)和嘔吐(16.7%)。腹瀉與嘔吐的頻次分別為6.08(±1.42)次/天和2.61(±1.37)次/天。 4.諾如病毒感染全年均可見(jiàn)到,高峰期出現(xiàn)在9月至12月,低谷期出現(xiàn)在6月至7月。 5.在42株諾如病毒中,發(fā)現(xiàn)3株重組型病毒,分別為2株GⅡ-4聚合酶/GⅡ-3衣殼重組株和1株GⅡ-6聚合酶/GⅡ-4衣殼重組株。 結(jié)論： 諾如病毒已經(jīng)成為濟(jì)南地區(qū)導(dǎo)致成人急性胃腸炎常見(jiàn)的病原體。感染常年可見(jiàn),高峰期主要出現(xiàn)在9月至12月,引起的常見(jiàn)臨床表現(xiàn)為腹瀉、腹痛、發(fā)熱和嘔吐。流行的諾如病毒基因呈多樣性,GⅡ-4為流行優(yōu)勢(shì)基因型,與全球的流行趨勢(shì)相吻合。諾如病毒基因組易發(fā)生重組,在本研究中也出現(xiàn)了3株重組病毒株,其中GⅡ-6聚合酶/GⅡ-4衣殼重組株在中國(guó)還是第一次發(fā)現(xiàn),應(yīng)該給予重視并進(jìn)行持續(xù)性觀察,避免引起大范圍的暴發(fā)流行。 第二部分濟(jì)南地區(qū)兒童輪狀病毒與諾如病毒感染的臨床與分子流行病學(xué)特征及兩者特征比較的研究 目的： 1.研究濟(jì)南地區(qū)5歲以下兒童急性胃腸炎患者中輪狀病毒感染情況、流行特征及臨床表現(xiàn)。 2.研究濟(jì)南地區(qū)5歲以下兒童急性胃腸炎患者中諾如病毒感染情況、流行特征及臨床表現(xiàn)。 3.研究濟(jì)南地區(qū)5歲以下兒童諾如病毒感染與輪狀病毒感染特征的比較。 方法： 1.自2011年2月至2012年1月在山東大學(xué)齊魯醫(yī)院兒科與山東大學(xué)齊魯兒童醫(yī)院收集767例5歲以下急性胃腸炎患兒的臨床資料與糞便標(biāo)本。其中門(mén)診患者502例,住院患者265例。標(biāo)本采集后立即混懸離心,提取上清液保存于-70℃直至用于提取病毒RNA。 2.提取每例糞便標(biāo)本中的病毒RNA,提取后立即用經(jīng)滅活RNA酶處理的超純水進(jìn)行稀釋,分裝后保存于-70℃待用。 3.采用ELISA的方法對(duì)每例糞便標(biāo)本進(jìn)行輪狀病毒的初步篩查,對(duì)陽(yáng)性標(biāo)本的病毒RNA采用針對(duì)不同基因型和血清型的引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。為避免ELISA假陰性結(jié)果的出現(xiàn),從陰性標(biāo)本中隨機(jī)抽取252例(50%)同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增。 4.擴(kuò)增獲得的輪狀病毒核酸序列進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,然后經(jīng)溴化乙錠染色在紫外線下觀察,鑒定不同基因型和血清型。 5.采用不同基因組型諾如病毒擴(kuò)增引物對(duì)所有糞便標(biāo)本提取的病毒RNA進(jìn)行核酸序列的擴(kuò)增,然后提純并進(jìn)行測(cè)序。所有核酸序列應(yīng)用BLAST程序同NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中保存的諾如病毒株序列進(jìn)行比對(duì),然后采用Clustal X與MEGA程序構(gòu)建進(jìn)化樹(shù),進(jìn)行流行基因型的分析。 6.對(duì)收集到的患兒臨床資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,所有均數(shù)以±SD表示,組間比較采用卡方檢驗(yàn)和U檢驗(yàn)的方法,P0.05代表具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1.在收集到的767例糞便標(biāo)本中,263例檢測(cè)出輪狀病毒陽(yáng)性,陽(yáng)性率為34.3%；80例檢測(cè)出諾如病毒陽(yáng)性,陽(yáng)性率為10.4%。其中混合感染為8例。 2.263例輪狀病毒株中,檢測(cè)出5種血清型和3種基因型,其中最常見(jiàn)的血清型和基因型分別為G3(40.7%)和P[8](46.8%)。 3.80例諾如病毒株全部來(lái)自于GⅡ基因組,分別為GⅡ-3,GⅡ-4和GⅡ6。最為流行的基因型為GⅡ-4(61.2%),分別屬于GⅡ-42004-2006和GⅡ-42006b兩個(gè)亞型。 4.輪狀病毒感染患者與諾如病毒感染患者平均年齡分別為24.2(±14.0)個(gè)月和19.9(±15.8)個(gè)月。通過(guò)U檢驗(yàn)兩者之間的差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 5.輪狀病毒感染的高峰期出現(xiàn)在11月至次年的1月,諾如病毒感染的高峰期出現(xiàn)在9月至11月。 6.輪狀病毒和諾如病毒感染患兒的主要臨床表現(xiàn)為腹瀉、嘔吐和發(fā)熱。輪狀病毒感染患兒的腹瀉與嘔吐平均頻次分別為5.08(±1.85)次/天和2.61(±1.35)次／天,體溫升高平均程度為38.0(4±0.65)。C；諾如病毒感染患兒的腹瀉與嘔吐平均頻次分別為4.99(±±1.55)次/天和2.20(±1.47)次/天,體溫升高平均程度為37.8(±0.62)。C。通過(guò)U檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)腹瀉頻率、嘔吐頻率和發(fā)熱程度之間的差異均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)的意義(P0.05)。 結(jié)論： 輪狀病毒與諾如病毒是濟(jì)南地區(qū)引起5歲以下兒童急性胃腸炎的常見(jiàn)病原體,最為流行的基因型分別為G3P[8]和GⅡ-4。輪狀病毒發(fā)病率明顯要高于諾如病毒的發(fā)病率,而且在臨床癥狀上表現(xiàn)的更為嚴(yán)重。感染常見(jiàn)于2歲以?xún)?nèi)的患兒,諾如病毒感染的患兒較輪狀病毒感染的患兒要小幾個(gè)月。最常見(jiàn)的癥狀是腹瀉、嘔吐和發(fā)熱。感染在一年中均可見(jiàn),但高峰期主要出現(xiàn)在秋冬季節(jié),而且諾如病毒感染的高峰期比輪狀病毒來(lái)的稍早。本研究展示了真實(shí)可靠的5歲以下兒童輪狀病毒與諾如病毒感染的流行病學(xué)和臨床表現(xiàn)特征,為病毒感染的預(yù)防、控制與治療提供科學(xué)的依據(jù)。
【圖文】：

圖1. 2010年6月至2011年5月濟(jì)南地區(qū)單月諾如病毒感染陽(yáng)性率統(tǒng)計(jì)圖2010年10月諾如病毒檢出率最高，為15.3%; 2010年6月最低，為4.1%。各月感染率分別為：4.1%，，4.5%, 6.0%, 13.3%, 15.3%, 14.3%，12.0%，7.5%,8.7%, 9.4%，8.6%, 6.1%。Fig.l Monthly distribution of norovirus infections between June 2010 and May2011 in Ji'nan.The highest detection rate (15.3%) was shown in October, 2010. The lowest

圖2. 2011年2月至2012年1月濟(jì)南地區(qū)單月輪狀病毒與諾如病毒感染率統(tǒng)計(jì)圖輪狀病毒感染的高峰期從11月開(kāi)始，持續(xù)到次年的1月；諾如病毒感染的高峰期從9月開(kāi)始，到11月結(jié)束。輪狀病毒每月感染率分別為：29.8%; 28.8%;25.9%; 27.9%; 27.4%; 23.4%; 24.3%; 32.8%; 30.1%; 62.2%; 51.3%; 37.9%；諾如病毒每月感染率分別為 8.5%; 11.5%; 13.0%; 7.4%; 6.5%; 6.3%; 8.6%; 13.4%; 17.2%;13.5%; 8.9%; 8.2%。Figure 2: Monthly distribution of rotavirus and norovirus infections betweenFebruary 2011 and January 2012 in Ji'nan.Rates of rotavirus infection: 29.8%; 28.8%; 25.9%; 27.9%; 27.4%; 23.4%;24.3%; 32.8%; 30.1%; 62.2%; 51.3%; 37.9%. Rates of norovirus infection; 8.5%;11.5%; 13.0%; 7.4%; 6.5%; 6.3%; 8.6%; 13.4%; 17.2%; 13.5%; 8.9%; 8.2%
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R512.5;R725.1

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5 徐潛;郎琳娜;張t

本文編號(hào)：2516358