【摘要】：第一部分單基因肥胖的分子遺傳學(xué)研究 在過(guò)去的十幾年中,肥胖人口的不斷增長(zhǎng)已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)公共衛(wèi)生事業(yè)的主要挑戰(zhàn)。作為一種復(fù)雜疾病,肥胖的產(chǎn)生除了與環(huán)境有關(guān)外,還與遺傳因素關(guān)系密切。據(jù)估計(jì)遺傳因素對(duì)體重的影響可能達(dá)40-70%。由此可見(jiàn),對(duì)肥胖產(chǎn)生分子機(jī)制的研究,具有十分重要的意義。鑒于肥胖成因的復(fù)雜性,對(duì)一些早發(fā)、極端、以單基因方式遺傳肥胖致病基因的研究成為了人們研究肥胖分子機(jī)制的突破口。目前人們已經(jīng)鑒定出20多種單基因肥胖的致病基因,但只能解釋不到5%的極端肥胖,對(duì)剩余肥胖分子機(jī)制的研究將是人們面臨的一個(gè)巨大挑戰(zhàn)。 人類生長(zhǎng)是一個(gè)受到多種因素影響的復(fù)雜過(guò)程,其中遺傳因素在身高決定中占主要作用。一直以來(lái),人們對(duì)于身材矮小的分子機(jī)制的研究較多,而對(duì)高大身材,特別是嬰幼兒及兒童期身材高大或過(guò)度生長(zhǎng)的分子機(jī)制研究相對(duì)較少。兒童期身材高大或者過(guò)度生長(zhǎng)可能由多種原因?qū)е?其中最常見(jiàn)的原因是肥胖和超重。因此,針對(duì)導(dǎo)致兒童期身材高大或過(guò)度生長(zhǎng)、肥胖或超重的致病基因鑒定對(duì)于人們理解兒童生長(zhǎng)和機(jī)體組成的機(jī)制具有十分重要的意義。 本研究中我們收集了1個(gè)常染色體顯性肥胖伴過(guò)度生長(zhǎng)家系和4個(gè)早發(fā)肥胖核心家系。在獲得知情同意后,對(duì)這5個(gè)家系進(jìn)行了分子遺傳學(xué)研究。 常染色體顯性肥胖伴過(guò)度生長(zhǎng)家系患者除了肥胖外,兩位處于青春期的患者身高要明顯高于同齡人,因此我們?cè)摷蚁得麨榉逝职檫^(guò)度生長(zhǎng)家系。我們首先在先證者中篩查了的23個(gè)基因,包括已報(bào)道的導(dǎo)致非綜合征型單基因肥胖的致病基因和一些在轉(zhuǎn)基因小鼠中發(fā)現(xiàn)與體重調(diào)節(jié)相關(guān)的基因。在排除這些基因的改變之后,我們使用Affymetrix SNP6.0芯片對(duì)部分家系成員分兩批進(jìn)行拷貝數(shù)分析和全基因組連鎖分析,在12號(hào)染色體長(zhǎng)臂和短臂各發(fā)現(xiàn)一段LOD值為2.4的區(qū)域。其中短臂區(qū)域位于rs10491968至rs11063753,長(zhǎng)度為1,975,647bp；長(zhǎng)臂區(qū)域位于rs17105259至rs10160961之間,長(zhǎng)度2,119,818bp。在得到連鎖結(jié)果后,我們?cè)谶B鎖區(qū)域附近選擇微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行驗(yàn)證和精細(xì)定位,將短臂的連鎖區(qū)域定位于D12S1050和D12S374之間,長(zhǎng)度為2,299,067bp,長(zhǎng)臂的連鎖區(qū)域定位于D12S313與12q/TG之間,長(zhǎng)度為1,391,386bp。同時(shí)分別在短臂標(biāo)記D12S1685與長(zhǎng)臂標(biāo)記12q/TTAT,當(dāng)0=0時(shí),獲得了最大LOD值2.68。 在進(jìn)行全基因組連鎖分析的同時(shí),我們對(duì)該家系的先證者進(jìn)行了全外顯子組測(cè)序。結(jié)合全基因組連鎖分析和外顯子組測(cè)序結(jié)果,我們?cè)谖挥?2號(hào)染色體短臂的EFCAB4B基因中發(fā)現(xiàn)了1個(gè)在家系患者中共分離的錯(cuò)義突變(p.R466W)。隨后我們?cè)?19例無(wú)關(guān)人群中對(duì)該變異進(jìn)行了驗(yàn)證。經(jīng)驗(yàn)證我們發(fā)現(xiàn)兩例無(wú)關(guān)個(gè)體(一個(gè)超重,一個(gè)體重正常)存在與家系內(nèi)患者相同的改變,因此暫不能確定我們所發(fā)現(xiàn)的變異是否是導(dǎo)致家系肥胖表型的分子基礎(chǔ)。 針對(duì)4個(gè)早發(fā)肥胖家系,我們根據(jù)家系內(nèi)先證者的臨床表現(xiàn),首先其中兩個(gè)家系先證者進(jìn)行MC4R、LEP和LEPR基因突變檢測(cè)。在家系2先證者中發(fā)現(xiàn)LEP基因一個(gè)純合的無(wú)義突變(c.163CT,p.Q55X),該突變?yōu)閲?guó)際首報(bào),其父母為該突變的攜帶者。為了驗(yàn)證其父母所攜帶的突變是否來(lái)自同一祖先,我們選擇LEP基因上下游各2Mb的微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)該家系進(jìn)行連鎖分析,從而確定了其父母所攜帶的突變來(lái)自于同一祖先。同時(shí),我們?cè)诩蚁?先證者中發(fā)現(xiàn)MC4R基因一個(gè)純合無(wú)義突變,其父母和子女為該突變的攜帶者。 對(duì)于另外兩個(gè)家系的先證者,我們則對(duì)已報(bào)道的導(dǎo)致單基因肥胖的致病基因和一些在轉(zhuǎn)基因小鼠中發(fā)現(xiàn)與體重調(diào)節(jié)相關(guān)的23個(gè)基因進(jìn)行了突變檢測(cè)。結(jié)果并沒(méi)有在這些基因中發(fā)現(xiàn)致病改變,但卻分別在兩個(gè)家系先證者中發(fā)現(xiàn)LEPR和SIMl基因的幾個(gè)與體重調(diào)節(jié)相關(guān)的SNP位點(diǎn)。 總之,在本研究中,我們使用全基因組連鎖分析和外顯子組測(cè)序等方法,在一個(gè)常染色體顯性肥胖伴過(guò)度生長(zhǎng)家系中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與患者共分離的罕見(jiàn)變異,盡管該變異的致病性還需要進(jìn)一步的確定,本文為肥胖這種復(fù)雜疾病分子機(jī)制的研究提供了新的思路。在兩個(gè)早發(fā)肥胖家系中分別發(fā)現(xiàn)了LEP、MC4R基因的純合無(wú)義突變,這是導(dǎo)致這兩個(gè)家系患者肥胖表型的分子基礎(chǔ)。其中LEP基因突變?yōu)橹袊?guó)人群中首次報(bào)道。 第二部分三種皮膚遺傳病的致病突變研究 皮膚病是指皮膚(包括皮膚附屬器官毛發(fā)、指甲、汗腺等)受到內(nèi)外因素的影響后,其形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能發(fā)生的病理改變。皮膚病的主要病因包括感染、過(guò)敏和遺傳因素影響。因遺傳物質(zhì)改變所引起的皮膚病稱為遺傳性皮膚病,有約300種單基因遺傳性皮膚病。本文對(duì)三種單基因遺傳性皮膚病(Bazex-Dupre-Christol綜合征、X連鎖無(wú)汗型外胚層發(fā)育不良和先天性無(wú)痛伴無(wú)汗)進(jìn)行了致病基因突變研究,尋找或鑒定三種遺傳性皮膚病的致病基因改變。 Bazex-Dupre-Christol綜合征(Bazex-Dupre-Christol syndrome, BDCS)(MIM301845)是一種罕見(jiàn)遺傳性皮膚病,1964年由Bazex等人首先報(bào)道。BDCS的患者通常表現(xiàn)出廣泛的皮膚癥狀,最為常見(jiàn)的臨床表現(xiàn)為少毛、毛囊性皮膚萎縮和早發(fā)的基底細(xì)胞癌的三聯(lián)征。除此之外,在一些病人中還會(huì)出現(xiàn)粟丘疹、少汗、顱面部色素沉著,毛發(fā)上皮瘤,毛干異常等表型。BDCS呈X連鎖顯性遺傳方式遺傳,其致病區(qū)域在2011年被定位于Xq25-q27.1區(qū)域11.4Mb的范圍內(nèi),但迄今尚未發(fā)現(xiàn)致病突變。本研究中我們收集了來(lái)自歐洲的兩個(gè)BDCS家系,采用全外顯子組測(cè)序技術(shù)及Affymetrix SNP6.0技術(shù)平臺(tái)對(duì)家系樣品進(jìn)行分析,以求能夠?qū)ふ业紹DCS的致病改變。在得到外顯子組測(cè)序結(jié)果后,我們首先對(duì)連鎖區(qū)域內(nèi)可疑改變進(jìn)行Sanger測(cè)序驗(yàn)證,但并沒(méi)有得到與疾病共分離的可疑改變。隨后我們對(duì)原始bam文件進(jìn)行分析,對(duì)連鎖區(qū)域內(nèi)外顯子組測(cè)序reads覆蓋率較低或未覆蓋區(qū)域,以及在連鎖區(qū)域中未出現(xiàn)在bam文件中的基因進(jìn)行補(bǔ)測(cè),結(jié)果并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)可疑致病改變。通過(guò)使用Affymetrix SNP6.0技術(shù)平臺(tái)對(duì)家系成員進(jìn)行拷貝數(shù)分析,發(fā)現(xiàn)兩個(gè)家系的患者都在Xq26.1-q26.2之間存在拷貝數(shù)增加,但該重復(fù)與DGV數(shù)據(jù)庫(kù)的已知CNV存在重疊,該拷貝數(shù)改變是否致病還需要進(jìn)一步的分析驗(yàn)證。 外胚層發(fā)育不良(Ectodermal Dysplasia, ED)是一類以牙齒、毛發(fā)、指甲等外胚層來(lái)源組織發(fā)育不良為特征的遺傳性綜合征的總稱。在這些綜合征中,最為常見(jiàn)的是X連鎖隱性少汗型外胚層發(fā)育不良(X-linked hypohidrotic ectodermal dysplasia, XLHED, MIM305100)。XLHED男性患者的臨床表現(xiàn)為無(wú)汗或少汗毛發(fā)稀疏或細(xì)黃、少牙或牙齒發(fā)育異常的三聯(lián)征。攜帶者女性由于X染色體的隨機(jī)失活會(huì)有不同程度的臨床表現(xiàn),另有30%左右的攜帶者不會(huì)表現(xiàn)出任何臨床癥狀。XLHED的致病基因?yàn)镋DA,定位于Xq12.2-q13.1。到目前為止,HGMD上共記錄了大約180種EDA基因的突變。其中98%以上的突變導(dǎo)致XLHED,另有約2%突變會(huì)引起另一種X連鎖疾�。篨連鎖顯性牙發(fā)育不良(X-linked dominant hypodontia, MIM300606)。本研究中我們收集了6個(gè)XLHED家系,對(duì)家系內(nèi)患者EDA基因各外顯子及外顯子-內(nèi)含子交界處進(jìn)行PCR擴(kuò)增后直接測(cè)序。我們?cè)?個(gè)家系中鑒定出6個(gè)致病突變,5個(gè)為點(diǎn)突變,1個(gè)缺失突變。其中1個(gè)點(diǎn)突變(p.Q358L)和缺失突變?yōu)槭状螆?bào)道的新突變。采用PCR產(chǎn)物酶切的方法,對(duì)p.Q358L進(jìn)行了驗(yàn)證。為了驗(yàn)證所發(fā)現(xiàn)的缺失突變,通過(guò)使用定量PCR以檢測(cè)先證者和其家系成員的相對(duì)拷貝數(shù)。為了確定先證者的缺失范圍,我們?cè)贓DA基因第7、8外顯子之間以及EDA基因3'UTR末端和其下游2.5kb、5kb、7.5kb范圍內(nèi)分別設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,從而將缺失范圍初步確定為第8外顯子上游至EDA基因下游5kb。結(jié)合GAP-PCR擴(kuò)增,最終將家系6先證者X染色體的缺失范圍確定為10,297bp,同時(shí)發(fā)現(xiàn)此缺失突變還導(dǎo)致位于EDA基因下游的AWAT2最后4個(gè)外顯子的缺失。另外,通過(guò)采用PCR直接測(cè)序和單體型分析的方法,我們對(duì)一個(gè)家系中的攜帶者進(jìn)行了產(chǎn)前基因診斷。結(jié)果顯示胎兒不攜帶致病突變,為正常男性。 先天性無(wú)痛伴無(wú)汗(Congenial insensitive to pain with anhidrosis, CIPA, MIM256800),是一種很罕見(jiàn)的常染色體隱性遺傳病。CIPA患者典型的臨床表現(xiàn)為對(duì)傷害性刺激無(wú)反應(yīng),無(wú)汗,屢現(xiàn)的高熱,自我傷害行為及智力遲緩。CIPA的致病基因?yàn)樯窠?jīng)營(yíng)養(yǎng)性酪氨酸激酶受體I型(Human neurotrophic tyrpsine kinase receptor type1, NTRK1),定位于1q21-22,編碼含790或796個(gè)氨基酸殘基的受體酪氨酸激酶TRKA。對(duì)于我們收集到的兩個(gè)CIPA家系,我們對(duì)家系內(nèi)患者NTRK1基因各外顯子及外顯子-內(nèi)含子交界處進(jìn)行PCR擴(kuò)增后直接測(cè)序。在家系1先證者NTRK1基因上發(fā)現(xiàn)三個(gè)錯(cuò)義突變(p.P397L, p.R692C, p.R771C),均為國(guó)際首報(bào)。其中P397L和R771C突變來(lái)自先證者的母親,而由于先證者的父親并不攜帶R692C突變,我們推測(cè)該突變可能是新生突變或者父親是該突變的嵌合體。通過(guò)PCR產(chǎn)物酶切的方法,我們?cè)?0名正常對(duì)照個(gè)體中分別對(duì)這 個(gè)突變進(jìn)行了驗(yàn)證。隨后我們采用在線預(yù)測(cè)工具SIFT和Polyphen對(duì)三個(gè)錯(cuò)義突變的致病性進(jìn)行了預(yù)測(cè),預(yù)測(cè)結(jié)果顯示R692C和R771C的致病性要強(qiáng)于P397L。另外,我們?cè)诩蚁?先證者NTRK1基因上發(fā)現(xiàn)了一個(gè)已知的純合突變,c.287+2dupT,其父母均為此突變的攜帶者。我們的發(fā)現(xiàn)有助于對(duì)這兩個(gè)家系進(jìn)行遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷,同時(shí)新的突變也擴(kuò)展了NTRK1的突變譜。 總之,對(duì)于這三種遺傳性皮膚病,我們采用了不同方法對(duì)其進(jìn)行了致病突變研究。通過(guò)對(duì)BDCS連鎖區(qū)域的致病突變篩查,我們基本排除了BDCS是由連鎖區(qū)域內(nèi)外顯子組區(qū)域突變致病的可能。通過(guò)對(duì)連鎖區(qū)域內(nèi)拷貝數(shù)分析,‘發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)家系患者Xq26.1-q26.2之間存在拷貝數(shù)的增加,其致病性需要進(jìn)一步確定。我們對(duì)XLHED和CIPA家系分別進(jìn)行了致病基因突變檢測(cè),鑒定出了每個(gè)家系的致病突變,包括5個(gè)新突變。我們的檢測(cè)結(jié)果有助于為患者家系提供遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷,同時(shí)所發(fā)現(xiàn)的新的突變也擴(kuò)展了EDA、NTRK1基因突變譜。
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【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R723.14

【參考文獻(xiàn)】

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1 牟曉冬;張志s，

本文編號(hào)：2474560