【摘要】：第一部分膿毒癥患者外周血單核細胞髓系細胞觸發(fā)受體-1表達水平與凋亡的相關性 研究目的：髓系細胞觸發(fā)受體-1(TREM-1)分子是主要表達于外周血單核細胞和中性粒細胞表面的受體,能夠放大Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)和Nod樣受體(Nod-like receptors, NLRs)介導的炎癥反應,在膿毒癥等炎癥性疾病發(fā)病機理中發(fā)揮重要作用。但是TREM-1在膿毒癥單核細胞和中性粒細胞凋亡中的作用尚未明確。因此,本部分研究通過檢測膿毒癥患者外周血單核細胞和中性粒細胞TREM-1的表達水平和細胞凋亡率,分析細胞TREM-1的表達水平和細胞凋亡之間的相關性。 研究方法： 本研究納入2012年7月1日至2012年9月4日大學附屬醫(yī)院外科ICU新入院膿毒癥患者為研究組,排除化療、艾滋病、激素治療和器官移植等患者。所有納入患者在入住重癥監(jiān)護病房(Intensive Care Unit, ICU)24小時內進行APACHE Ⅱ (Acute Physiology and Chronic Health Evaluation Ⅱ)評分和SOFA(Sequential Organ Failure Assessment)評分。所有納入患者在入住ICU24小時內均抽取全血檢測全血中單核細胞和中性粒細胞的凋亡水平；同時將全血中的單核細胞和中性粒細胞分離,檢測兩種細胞TREM-1的表達水平。分別分析單核細胞和中性粒細胞TREM-1表達水平與其凋亡率的相關性。 研究結果： 本研究共納入外科ICU中符合膿毒癥診斷標準的26例患者。在原發(fā)疾病中最常見的為急性腹膜炎(26.9%)和肺炎(26.9%),其他還包括急性化膿性梗阻性膽管炎和急性重癥胰腺炎等。其中16例患者細菌培養(yǎng)結果陽性,另外10例患者存在臨床感染證據(jù)。所有患者的外周血單核細胞都檢測到TREM-1表達水平和細胞凋亡率,相關性分析顯示單核細胞TREM-1表達水平和單核細胞凋亡率成負相關(r=-0.49,P=0.01)。此外,26例患者中有22例成功檢測到中性粒細胞TREM-1表達水平與中性粒細胞凋亡率,4例患者檢測失敗。中性粒細胞TREM-1表達水平與中性粒細胞凋亡率之間無顯著相關性(r=-0.28,P=0.21)。 研究結論： 膿毒癥患者外周血單核細胞TREM-1表達水平與單核細胞凋亡率呈負相關,中性粒細胞TREM-1表達水平與中性粒細胞凋亡率無顯著相關性。研究結果提示：TREM-1在單核細胞抗凋亡中可能具有重要作用。 第二部分TREM-1在單核細胞凋亡中的作用并初步探討其分子機制 研究目的： 通過構建攜帶TREM-1基因的重組腺病毒表達載體,獲得高表達TREM-1的單核細胞,進行TREM-1在單核細胞凋亡中的作用及其機制的研究,探討Erk和PI3K/Akt通路和Bcl-2蛋白家族在該凋亡機制中的作用。研究方法： 構建高表達TREM-1的腺病毒表達載體,感染單核細胞系THP-1細胞,用Western blot和流式細胞術檢測TREM-1蛋白的表達水平。以高表達TREM-1的THP-1細胞為研究對象,采用激動性抗體激活TREM-1通路,或同時用100ng/ml脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)刺激,隨后用星形孢菌素(staurosporine, STS)誘導該細胞凋亡,采用流式細胞術檢測細胞凋亡水平。采用化學抑制試驗觀察細胞外信號調節(jié)激酶(extracellular-signal-regulated kinase, Erk)通路和磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol3-kinase, PI3K)/Akt通路對TREM-1分子介導的細胞凋亡的影響。采用Western blot法技術檢測Bcl-2蛋白家族在TREM-1分子介導的細胞凋亡中的表達水平變化。 研究結果： Western-blot和流式細胞術檢測證實TREM-1重組腺病毒載體構建成功,能在單核細胞系THP-1細胞中穩(wěn)定表達。激活TREM-1通路能顯著降低STS誘導的THP-1細胞的凋亡率(41.8%vs.63%,p0.05),且在LPS刺激誘導的THP-1細胞(體外炎癥模型)中也得到了相似的結果(33.7%vs.54.3%,p0.05)。用化學藥物抑制細胞外信號調節(jié)激酶(extracellular-signal-regulated kinase, Erk)或磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol3-kinase, PI3K)/Akt通路的活化,能夠減弱TREM-1對THP-1凋亡的抑制作用(Erk抑制劑：29.8%vs.77.7%, p0.05; PI3K/Akt抑制劑：29.8%vs.69.3%, p0.05)。Western blot結果顯示TREM-1的激活不僅能顯著地提高Bcl-2蛋白家族中抗凋亡蛋白髓樣細胞白血病-1(myeloid cell leukemia-1, Mcl-1)的表達,而且還能逆轉STS對Mcl-1蛋白的抑制作用(p0.05)。 研究結論： 本研究證實激活TREM-1對單核細胞具有抗凋亡作用,其機制可能與Erk和Akt信號通路的激活、以及下游抗凋亡蛋白Mcl-1的表達升高有關。 第三部分明確Mcl-1分子在TREM-1介導單核細胞抗凋亡通路中的重要作用 研究目的： 探討上述研究中發(fā)現(xiàn)的髓樣細胞白血病-1(myeloid cell leukemia-1, Mcl-1)蛋白在單核細胞TREM-1抗凋亡通路中的確切作用,從而明確單核細胞表面TREM-1分子在細胞凋亡、免疫調控中的重要作用。 研究方法： 以高表達TREM-1的THP-1細胞為研究對象,采用化學抑制劑抑制TREM-1通路的下游分子Erk和Akt,Western blot方法檢測Mcl-1蛋白水平的變化。采用激動性TREM-1抗體激活TREM-1受體后,加入特異性抑制Mcl-1蛋白表達的Roscovitine (20μM)與0.6μg/ml STS,流式細胞術觀察Mcl-1蛋白抑制后對TREM-1發(fā)揮抗凋亡作用的影響。 研究結果： 抑制Erk和/或Akt信號分子均導致Mcl-1蛋白表達顯著下降(p0.05)。20μM Roscovitine處理4小時后,TREM-1-THP-細胞的Mcl-1蛋白表達明顯被抑制(p0.05)。將激活TERM-1通路的TREM-1-THP-1細胞用20μM Roscovitine處理后,TREM-1的抗凋亡作用被抑制(68.1%vs.39.5%,p0.05)。 研究結論： 本研究證實TREM-1可能是通過激活的Erk和Akt通路上調Mcl-1蛋白發(fā)揮抗凋亡作用,Mcl-1蛋白可能是TREM-1抗凋亡通路中的重要分子。
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【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R720.597

【參考文獻】

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1 徐笑益,方向明;全身性感染發(fā)病機制及治療的研究進展[J];國外醫(yī)學.麻醉學與復蘇分冊;2005年01期

2 胡皓夫;;與國際接軌,提高我國兒童膿毒癥的診治水平[J];中華急診醫(yī)學雜志;2006年06期

3 劉娟;錢素云;;小兒膿毒癥和嚴重膿毒癥發(fā)病情況單中心調查[J];臨床兒科雜志;2010年01期

4 陳齊興;周景琳;Malte Book;Frank Stuber;方向明;;白細胞介素-10對人外周血白細胞β-防御素2基因誘導性表達的影響[J];浙江大學學報(醫(yī)學版);2006年06期

5 胡艷;舒力琪;陳齊興;姚航平;;髓系細胞觸發(fā)受體-1真核表達質粒的構建及鑒定[J];浙江大學學報(醫(yī)學版);2010年05期

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本文編號：2317774