本文選題：Pin1 + 慢病毒載體��； 參考：《瀘州醫(yī)學院》2014年碩士論文

【摘要】：目的：Pin1是人類肽基脯氨酰異構(gòu)酶，現(xiàn)在主要用于研究抑制腫瘤細胞的靶點。而目前研究發(fā)現(xiàn)，Pin1參與氧化應(yīng)激通路，抑制其表達將可能減少高氧肺損傷，但具體作用機制研究鮮有報道。RNAi技術(shù)是目前公認能夠快速有效的基因沉默方式，其可高效、特異性下調(diào)目標基因的表達，研究基因功能和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，越來越受到人們的關(guān)注。本實驗擬構(gòu)建Pin1shRNA慢病毒載體，建立穩(wěn)定抑制肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶（Pin1）表達的A549細胞系，從而探討Pin1在氧化應(yīng)激通路介導(dǎo)高氧誘導(dǎo)人肺泡Ⅱ型上皮A549細胞凋亡的作用。 方法：根據(jù)查閱文獻獲得Pin1shRNA干擾靶點序列并插入pLenR-GPH載體，構(gòu)建pLenR-GPH-Pin1shRNA慢病毒載體，隨后轉(zhuǎn)入人胚腎HEK293T細胞中,收集其上清進行病毒滴度測定，再行慢病毒的包裝，將獲得的慢病毒毒液感染A549。通過實時定量PCR（qRT-PCR）及Western blot法檢測Pin1在不同組的表達抑制情況，最終獲得穩(wěn)定抑制Pin1表達的A549-Pin1shRNA細胞系。隨后將實驗分為四組：空氣組、高氧組、空載體組以及A549-Pin1shRNA高氧組。高氧組、A549-Pin1shRNA高氧組及空載體組均以高體積分數(shù)氧（高氧）誘導(dǎo)細胞，即通入3L/min的90%氧氣和5%二氧化碳高純混合氣10min，并在培養(yǎng)箱中密培養(yǎng)24h�？諝饨M則是含有10%胎牛血清和1%青鏈霉素的1640培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后收集細胞進行以下檢測:倒置相差顯微鏡下觀察各組細胞的形態(tài)學改變；流式細胞術(shù)檢測各組細胞在高氧誘導(dǎo)下凋亡率的影響；采用SP細胞免疫化學方法檢測各組細胞中Caspase-9、 XIAP蛋白的表達;熒光顯微鏡檢測各組細胞線粒體活性氧簇產(chǎn)生的情況以及熒光顯微鏡檢測各組細胞線粒體膜電位的變化。 結(jié)果：(1)經(jīng)限制性內(nèi)切酶鑒定及測序分析，成功構(gòu)建了pLenR-GPH-Pin1shRNA慢病毒載體質(zhì)粒,包裝并得到高滴度的病毒顆粒。通過qRT-PCR和Western blot檢測顯示，與對照組相比，轉(zhuǎn)染pLenR-GPH-Pin1shRNA慢病毒載體感染的A549細胞中Pin1的表達在mRNA和蛋白兩個水平均有所下降，成功構(gòu)建了A549-Pin1shRNA細胞系。(2)在倒置顯微鏡下，常規(guī)培養(yǎng)的細胞生長狀態(tài)良好，活細胞數(shù)量較多，少見細胞漂浮，細胞呈梭形，細胞間隙較小，連接緊密。高氧組及空載體組細胞均呈現(xiàn)出生長狀態(tài)差，活細胞明顯較常規(guī)培養(yǎng)減少，培養(yǎng)基中可見大量圓形細胞漂浮，剩下的活細胞排列松散，間隙明顯增寬。而A549-Pin1shRNA高氧組生長狀態(tài)欠佳，活細胞數(shù)量較高氧組及空載體多，懸浮細胞數(shù)較高氧組及空載體組少，但未達到空氣組水平；(3)流式細胞術(shù)結(jié)果顯示：高氧組與空載體相比，細胞凋亡率相近，差異不具有統(tǒng)計學意義（P0.05）。高氧組、空載體與空氣組相比，細胞凋亡率明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P0.05）；而A549-Pin1shRNA高氧組的凋亡率有所降低，其值介于高氧組與空氣組之間，與高氧組、空氣組相比差異有統(tǒng)計學意義（P0.05）;(4)免疫組化結(jié)果顯示，高氧組與空載體在Caspase-9、 XIAP蛋白表達無明顯差異（P0.05），其二者與空氣組相比，Caspase-9蛋白表達明顯增加，XIAP蛋白明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P0.05）。在A549-Pin1shRNA高氧組中的表達Caspase-9、 XIAP蛋白表達量介于高氧組與空氣組之間，差異有統(tǒng)計學意義（P0.05）。(5)熒光顯微鏡檢測各組細胞中線粒體活性氧簇產(chǎn)生的情況：線粒體活性氧簇染色成紅色熒光，細胞核染成藍色熒光�？諝饨M紅色熒光表達微弱。而高氧組及空載體組細胞紅色熒光表達二者之間無明顯差異（P0.05），，但與空氣組對比，其ROS的熒光表達明顯增加，差異有顯著性（P＜0.05）；A549-Pin1shRNA高氧組紅色熒光含量較高氧組有所減少，差異有顯著性（P＜0.05），但未減少至空氣組水平（P＜0.05）。(6)熒光顯微鏡檢測各組細胞線粒體膜電位的變化：與空氣組相比，高氧組及空載體組線粒體膜電位均明顯下降，差異有顯著性（P＜0.05），而在高氧組及空載體組二者之間膜電位下降無明顯差異（P0.05）；與高氧組相比A549-Pin1shRNA高氧組線粒體膜電位升高，差異有顯著性（P＜0.05），但仍未達到空氣組水平（P＜0.05）。 結(jié)論：1、成功構(gòu)建Pin1shRNA慢病毒載體其高效感染體外培養(yǎng)的人肺泡上皮細胞A549，構(gòu)成穩(wěn)定A549-Pin1shRNA細胞系，并可顯著抑制Pin1在mRNA和蛋白水平的表達。2、在高氧環(huán)境下能夠誘導(dǎo)細胞內(nèi)PKCβ表達增多，從而Pin1表達也有所增多,Pin1能夠介導(dǎo)p66shc發(fā)生磷酸化,使其轉(zhuǎn)位于線粒體,最終導(dǎo)致線粒體活性氧產(chǎn)生增多，線粒體膜電位下降。通過抑制Pin1的表達，減少線粒體ROS的產(chǎn)生，減輕△Ψ m下降，減少細胞凋亡及Caspase-9的產(chǎn)生，增加XIAP，從而減輕高氧誘導(dǎo)的人肺泡上皮細胞的損傷，有望成為高氧肺損傷新的治療途徑。
[Abstract]:Objective : Pin1 is a human peptide - based proline isomerase , which is mainly used to study the target of inhibiting tumor cells .

Methods : Pin1shRNA interfering target sequence was obtained and inserted into pLenR - GPH vector to construct pLenR - GPH - Pin1shRNA lentivirus vector , then transferred into human embryo kidney - bearing 293 cells .
Flow cytometry was used to detect the apoptosis rate of each group in high oxygen - induced apoptosis .
The expression of Caspase - 9 and XIAP protein in each group was detected by SP cell immunochemistry method , and the changes of mitochondrial membrane potential in each group were detected by fluorescence microscope .

Results : ( 1 ) The expression of Pin1 in A549 cells infected with pLenR - GPH - Pin1shRNA lentivirus vector was successfully constructed by restriction endonuclease identification and sequencing .
( 3 ) Flow cytometry showed that the apoptosis rate was similar between high oxygen group and empty vector ( P0.05 ) .
Compared with air group , the expression of Caspase - 9 and XIAP decreased significantly ( P0.05 ) . Compared with air group , the expression of Caspase - 9 and XIAP decreased significantly ( P0.05 ) .
Compared with air group , the mitochondrial membrane potential of A549 - Pin1shRNA high oxygen group decreased significantly ( P < 0.05 ) , but there was no significant difference between the high oxygen group and the empty carrier group ( P < 0.05 ) .
Compared with hyperoxia group , the mitochondrial membrane potential of A549 - Pin1shRNA high oxygen group increased significantly ( P & lt ; 0.05 ) , but the air group level was still not reached ( P & lt ; 0.05 ) .

Conclusion : 1 . Pin1 shRNA lentivirus vector is successfully constructed to infect human alveolar epithelial cells A549 . It is a stable A549 - Pin1shRNA cell line , which can significantly inhibit the expression of Pin1 in mRNA and protein levels .
【學位授予單位】：瀘州醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R722

【參考文獻】

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本文編號：2092813