本文選題：腎積水 + 腎盂輸尿管連接部梗阻�。� 參考：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2013年博士論文

【摘要】：背景：先天性腎盂輸尿管連接部梗阻(ureteropelvic junctionobstruction, UPJO)是小兒腎積水最常見(jiàn)的原因，可導(dǎo)致患腎實(shí)質(zhì)受壓變薄、腎功能進(jìn)行性減退，嚴(yán)重影響患兒健康。UPJO的發(fā)病機(jī)制目前仍不清楚，但梗阻段的組織學(xué)改變已基本明確，表現(xiàn)為平滑肌減少、萎縮、肌層變薄，肌層神經(jīng)纖維減少及間質(zhì)內(nèi)膠原纖維沉積。在這些組織學(xué)特點(diǎn)中，平滑肌減少和萎縮為主要改變，因此以平滑肌的發(fā)育為切入點(diǎn)進(jìn)行研究，有望闡明UPJO的發(fā)病機(jī)制。Bmp4是骨形成蛋白家族成員，可通過(guò)Smads通路調(diào)控相應(yīng)靶基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的分化、增殖和凋亡。Id2是Bmp4靶基因中功能最為重要的一員，在多種細(xì)胞中均有表達(dá)，其基本生理功能為促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞分化。有研究顯示Bmp4-Id2信號(hào)軸在骨骼肌細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞的增殖、分化中具有重要調(diào)控作用，但其在輸尿管平滑肌形成中的作用及機(jī)制尚不明確。在輸尿管芽發(fā)出時(shí)，其周?chē)g充質(zhì)細(xì)胞內(nèi)可檢測(cè)到Bmp4高水平表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Bmp4具有抑制輸尿管芽異位及促進(jìn)輸尿管芽分支向后腎延伸的雙重作用，體內(nèi)或體外抑制Bmp4的功能均會(huì)引起胚胎期輸尿管平滑肌發(fā)育異常。文獻(xiàn)報(bào)道敲除Id2基因的小鼠出現(xiàn)腎積水表型，且腎盂輸尿管連接部的組織學(xué)改變與人類(lèi)UPJO類(lèi)似。因此研究BMP4-ID2信號(hào)軸與人類(lèi)UPJO的相關(guān)性及其在胚胎輸尿管平滑肌發(fā)育過(guò)程中的作用，對(duì)揭示UPJO的發(fā)生機(jī)制具有重要意義。本文的主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下： 第一部分BMP4、ID2在先天性腎盂輸尿管連接部梗阻患者腎盂輸尿管連接部組織中的表達(dá) 目的：檢測(cè)BMP4、ID2在UPJO患者腎盂輸尿管連接部（UPJ）組織的表達(dá)，明確BMP4、ID2與先天性UPJO發(fā)生的相關(guān)性。 方法： 1.收集UPJO患兒UPJ組織，以腎母細(xì)胞瘤患者未受腫瘤侵犯的正常UPJ組織作為對(duì)照。 2.通過(guò)masson三色法檢測(cè)UPJ組織學(xué)改變，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Q-PCR）、免疫組化S-P法及western blot檢測(cè)BMP4、ID2mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)。 結(jié)果： 1. UPJO患者UPJ組織的主要改變?yōu)椋浩交∈儽　⒓咏Y(jié)構(gòu)紊亂，部分病例表現(xiàn)為外層環(huán)肌較少、內(nèi)層縱肌增生；同時(shí)伴有間質(zhì)內(nèi)膠原纖維沉積。 2. BMP4、ID2蛋白質(zhì)表達(dá)于UPJ組織的粘膜層及平滑肌層，病例組二者的mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)均降低；提示BMP4、ID2與先天性UPJO的發(fā)生密切相關(guān)，UPJO梗阻段平滑肌發(fā)育異�？赡苡膳咛テ贐MP4、ID2表達(dá)降低引起。 第二部分先天性腎盂輸尿管連接部梗阻患者BMP4、ID2基因突變分析 目的：檢測(cè)UPJO患者BMP4、ID2基因是否存在基因突變，明確其是否與BMP4、ID2表達(dá)降低相關(guān)。 方法： 1.收集UPJO患者及健康對(duì)照兒童靜脈外周血標(biāo)本，提取基因組DNA；PCR擴(kuò)增BMP4、ID2基因蛋白質(zhì)編碼區(qū)。 2.直接測(cè)序法檢測(cè)PCR產(chǎn)物的堿基序列，應(yīng)用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)突變位點(diǎn)的功能。 結(jié)果： 1. UPJO患者BMP4基因存在一個(gè)有義突變及一個(gè)無(wú)義突變，即c.485G㧐A (p.R162Q)、c.1167T㧐C (p.Y389Y)；ID2基因存在一個(gè)無(wú)義突變，即c.108A㧐G (p.L36L)。 2.生物信息學(xué)預(yù)測(cè)c.485G㧐A (p.R162Q)突變可能引起B(yǎng)MP4蛋白的功能異常。 第三部分Id2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其在小鼠成肌細(xì)胞C2C12中的表達(dá) 目的：構(gòu)建Id2真核過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，并檢測(cè)其轉(zhuǎn)染入C2C12細(xì)胞后能否表達(dá)目的基因。 方法： 1.應(yīng)用化學(xué)合成法合成小鼠Id2基因蛋白質(zhì)編碼區(qū)，將該序列連接到GV230載體的多克隆位點(diǎn)構(gòu)建重組質(zhì)粒，并通過(guò)酶切及基因測(cè)序鑒定。 2.將Id2/GV230重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞，于轉(zhuǎn)染后24h、48h檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率；再用RT-PCR及western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后48h Id2mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)。 結(jié)果： 1. Id2/GV230重組質(zhì)粒在XhoI和KpnI雙酶切下，可得到大小為406bp的目的基因片段；基因測(cè)序顯示目的片段的堿基序列與小鼠Id2蛋白質(zhì)編碼區(qū)相同。 2.轉(zhuǎn)染24h、48h后的轉(zhuǎn)染效率分別為(18.8±2.5)%、(19.2±2.7)%，，兩者無(wú)明顯差異。轉(zhuǎn)染組Id2mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)水平明顯升高。 第四部分Bmp4拮抗及Id2過(guò)表達(dá)對(duì)小鼠胚胎輸尿管平滑肌發(fā)育的影響 目的：明確Bmp4、Id2是否參與胚胎期輸尿管平滑肌的發(fā)育，證實(shí)Bmp4對(duì)平滑肌的發(fā)育調(diào)控作用部分通過(guò)Id2介導(dǎo)。 方法： 1.取孕12.5天（E12.5d）BALB/c小鼠胚胎腎臟及輸尿管進(jìn)行體外培養(yǎng)，分為正常對(duì)照組、Noggin拮抗組（Noggin組）及Noggin拮抗、Id2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（Id2組）。 2.在培養(yǎng)的24h后，Noggin組、Id2組各加入Bmp4拮抗劑Noggin5μg（濃度5μg/ml）。3d后換液并在Id2組中加入Id2/GV230過(guò)表達(dá)質(zhì)粒（質(zhì)粒2μg，PolyJet DNA轉(zhuǎn)染試劑8μl），48h后取培養(yǎng)組織冰凍切片，通過(guò)免疫熒光檢測(cè)各組標(biāo)本輸尿管平滑肌肌球蛋白α-SMA的表達(dá)。結(jié)果： 1.胚胎腎臟體外培養(yǎng)6天后組織狀態(tài)良好。Noggin拮抗組α-SMA的表達(dá)明顯降低，提示Bmp4在胚胎輸尿管平滑肌的形成中具有重要作用。 2. Bmp4部分拮抗后，Id2過(guò)表達(dá)能夠一定程度地恢復(fù)胚胎輸尿管α-SMA的表達(dá)；提示Id2能夠促進(jìn)胚胎輸尿管平滑肌細(xì)胞的形成，Bmp4對(duì)胚胎輸尿管平滑肌發(fā)育的調(diào)控部分通過(guò)Id2介導(dǎo)。 結(jié)論： 1. BMP4-ID2信號(hào)軸與先天性UPJO的發(fā)生密切相關(guān)，UPJO梗阻段平滑肌發(fā)育異�？赡苡膳咛テ贐MP4、ID2表達(dá)降低引起。 2. UPJO患者BMP4基因存在突變位點(diǎn)，即c.485G㧐A (p.R162Q)，這一突變可能是導(dǎo)致BMP4、ID2表達(dá)降低的原因之一；但其突變率較低（約1%），因此繼續(xù)闡明可導(dǎo)致基因表達(dá)降低的其它因素，如患者UPJ組織中BMP4、ID2是否存在表觀遺傳學(xué)的異常等，還需進(jìn)一步研究。 3.初步證實(shí)了Id2具有促進(jìn)輸尿管平滑肌形成的作用，這一效應(yīng)可能通過(guò)促進(jìn)已分化平滑肌細(xì)胞的增殖來(lái)實(shí)現(xiàn)；再次證實(shí)了Bmp4能促進(jìn)胚胎期輸尿管平滑肌的發(fā)育，這一功能部分通過(guò)Id2介導(dǎo)。
[Abstract]:Background: congenital ureteropelvic junction obstruction (ureteropelvic junctionobstruction, UPJO) is the most common cause of hydronephrosis in children. It can lead to the thinning of the renal parenchyma and the progressive degeneration of renal function. The pathogenesis of the healthy.UPJO in children is still unclear, but the histological changes of the obstructive segment have been basically clear. In these histological features, smooth muscle reduction and atrophy are the main changes in these histological features, and the development of smooth muscle is the breakthrough point. It is expected that the pathogenesis of UPJO,.Bmp4, is a member of the bone morphogenetic protein family, which can be used by Smads. The pathway regulates the expression of the corresponding target gene, and then regulates the differentiation of multiple cells, and the proliferation and apoptosis of.Id2 are the most important members of the Bmp4 target gene, which are expressed in various cells. The basic physiological function is to promote cell proliferation and inhibit cell differentiation. The research shows that the Bmp4-Id2 signal axis is in the skeletal muscle cells and the vascular smooth muscle. The role and mechanism of cell proliferation and differentiation is important, but its role and mechanism in the formation of ureteral smooth muscle is not clear. Bmp4 high level can be detected in the peripheral mesenchyme cells when the ureteral buds are sent out. Further studies have found that Bmp4 can inhibit ectopic ureteral buds and promote the extension of the ureteral buds to the posterior renal extension. Both in vivo and in vitro inhibition of Bmp4 function in both in vivo and in vitro can cause abnormal development of the ureteral smooth muscle in the embryonic stage. It is reported that the hydronephrosis phenotype of the mice with Id2 gene knockout and the histological changes of the ureteropelvic junction are similar to that of human UPJO. Therefore, the correlation of the BMP4-ID2 signal axis and human UPJO and its embryo transfer are studied. The role of urethral smooth muscle development is of great significance in revealing the mechanism of UPJO.
Part one: expression of BMP4 and ID2 in ureteropelvic junction tissues of patients with congenital ureteropelvic junction obstruction
Objective: to detect the expression of BMP4 and ID2 in ureteropelvic junction (UPJ) of UPJO patients, and to clarify the correlation between BMP4 and ID2 and the occurrence of congenital UPJO.
Method錛

本文編號(hào)：2037545