本文選題：CVB3 + 病毒性心肌炎��； 參考：《北京協(xié)和醫(yī)學院》2012年博士論文

【摘要】：柯薩奇病毒的B組(CVB)是侵犯人類心肌引起病毒性心肌炎的首位病原體,其中尤其3型(CVB3)最常見。病毒性心肌炎在兒科臨床是常見的一種傳染病,而成人散發(fā)。感染后可出現(xiàn)發(fā)熱,發(fā)病后可引起突然的、急性心力衰竭,死亡率高。病毒性心肌炎可發(fā)展為擴張性心肌病。CVB3導致病毒性心肌炎的發(fā)病機制主要由病毒直接作用與病毒感染后引起機體高免疫炎癥性反應所致。關于病毒性心肌炎,目前臨床缺乏有效的預防手段與特異的治療藥物。因此對CVB3感染的預防與治療研究都亟待必行。因而有必要對CVB3的病原學與CVB3的致病機制進行深入研究,為開發(fā)有效的預防與治療藥物提供科學依據(jù)。因此我們進行了如下兩部分工作。 第一部分：初步分析特異性microRNAs(miRNAs)在CVB3病毒性心肌炎發(fā)病中的變化和對免疫炎性反應可能的調控作用。目的：利用小鼠病毒性心肌炎動物模型,來評估m(xù)iRNAs在病毒性心肌炎發(fā)病機制中的作用。方法：用表達譜芯片分別檢測病毒組與對照組小鼠心臟組織microRNA與mRNA的差異表達。使用實時RT-PCR對差異表達的基因進行驗證。用miRBase、miRanda與TargetScan3個數(shù)據(jù)庫預測差異表達的microRNA靶基因并取交集。使用Gene Ontology(GO)與Kyoto Encyclopedia Genes and Genomes (KEGG)軟件檢測靶基因的功能與生物學通路,分析miRNAs的調控作用。結果：有64個microRNAs出現(xiàn)變化,其中5個microRNAs有生物學統(tǒng)計意義(p0.05)。分別是miR-146a、miR-23a、miR-21、 miR-374、miR-29a*。這5個差異表達的microRNAs參與調節(jié)體內(nèi)重要的免疫學通路,如Toll-樣受體(TLR)信號通路、RIG-I樣受體(RLR)信號通路、細胞因子與受體相互作用通路、MAPK信號通路、JAK-STAT信號通路,并且經(jīng)實時RT-PCR實驗驗證了這些通路的某些信號蛋白是差異表達的miRNAs的靶基因。結論：在CVB3病毒性心肌炎的發(fā)病機制中,病毒感染后,多個與免疫調節(jié)通路相關的特異性miRNAs產(chǎn)生變化,并同時與心肌炎發(fā)病有關的炎癥因子的變化相關。這個研究有助于深入理解病毒性心肌炎的發(fā)病機理,為開發(fā)抗CVB3感染與病毒性心肌炎治療藥物提供了新的視角。 第二部分：探索柯薩奇病毒非編碼區(qū)外源microRNA插入的穩(wěn)定性。目的：利用pCMV5/CVB3感染性克隆質粒,在其CVB3序列兩側的5’端與3’端非編碼區(qū)分別插入心肌組織特異的內(nèi)源性microRNAs的互補序列,構建含miRNAs互補序列的重組CVB3病毒,觀察其復制的穩(wěn)定性,為新型CVB3分子減毒疫苗株的研究奠定基礎。方法：利用分子克隆技術和microRNA的操作技術,將合成單一和三串聯(lián)的miRNAs經(jīng)退火制備成雙鏈miRNAs,分別在CVB3序列的5'UTR和3'UTR選點插入。用重組病毒質粒轉染Hela細胞,觀察其能否恢復為完整的病毒顆粒,將重組病毒感染TE671細胞,并提取病毒RNA進行測序鑒定。結果：5’端插入構建的重組病毒質粒經(jīng)測序確定后,將其轉染不含內(nèi)源性miR-133的Hela細胞后能夠轉錄出完整的病毒顆粒,細胞產(chǎn)生明顯病變,并且用RT-PCR及WesternBlot鑒定為完整病毒顆粒。感染含有內(nèi)源性miR-133的TE671細胞不出現(xiàn)病變,證明內(nèi)源性miR-133識別重組CVB3序列中的miR-133互補鏈并產(chǎn)生對CVB3復制及翻譯抑制作用。當在Hela細胞連續(xù)傳3代后,再用重組病毒感染含有miR-133序列的TE671細胞也出現(xiàn)病變,提取重組病毒RNA測序發(fā)現(xiàn)miR-133序列被切除,相鄰的病毒序列沒有發(fā)生改變。做重復實驗得到同樣的結果。因此我們繼續(xù)在3’端尋找構建點,經(jīng)多步克隆完成構建,重組病毒質粒轉染Hela細胞后能夠轉錄出完整的病毒顆粒,復制良好。目前正在用重組病毒感染含有miR-133的TE671細胞并觀察,同時進行多次傳代觀察其插入穩(wěn)定性。結論：在CVB3基因組5'UTR的BstBI位點插入外源miR-133互補序列后,由于5'UTR功能區(qū)較多,影響了病毒的復制,并導致病毒基因組出現(xiàn)不穩(wěn)定,經(jīng)多次傳代后易發(fā)生病毒回復的情況。病毒在復制過程中把外源序列切除的目的是保證其基因組在進化上的穩(wěn)定性。因此認為在構建重組CVB3病毒時,避開5'UTR該位點區(qū)。目前觀察到3'UTR區(qū)插入外源序列無論從理論上和實際的結果上還是存在可行性的。
[Abstract]:CVB3 is the first pathogen of viral myocarditis caused by human cardiac muscle , especially type 3 ( CVB3 ) . It is common in pediatric clinic . Viral myocarditis can develop into dilated cardiomyopathy . The pathogenesis of viral myocarditis can be caused by viral myocarditis . It is necessary to study the pathogenesis of CVB3 . Therefore , it is necessary to study the pathogenesis of CVB3 and provide scientific basis for the development of effective prevention and treatment . Therefore , we have done the following two parts .

Objective : To investigate the role of microRNAs in the pathogenesis of viral myocarditis by using gene Ontology ( GO ) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes ( KEGGS ) .

A recombinant CVB3 virus containing miR - 133 was transfected into Hela cells .
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R725.1

【參考文獻】

相關期刊論文 前3條

1 陳新;曾長英;盧誠;王文泉;;基于PCR技術的miRNA定量檢測方法[J];中國生物工程雜志;2010年11期

2 冉斌;趙學會;;綜合療法治療病毒性心肌炎的療效觀察[J];西部醫(yī)學;2009年08期

3 景花;宋沁馨;周國華;;MicroRNA定量檢測方法的研究進展[J];遺傳;2010年01期

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本文編號：1928746