本文選題：ABCB11基因　切入點(diǎn)：肝內(nèi)膽汁淤積　出處：《南京大學(xué)》2014年碩士論文

【摘要】：背景與目的：膽汁淤積是嬰兒肝炎綜合征最常見(jiàn)的表型之一,病因多種多樣,其中由各種基因突變引起的遺傳因素是僅次于膽道閉鎖引起膽汁淤積的第二大病因。人類ABCB11基因編碼表達(dá)一種稱作膽鹽輸出泵的膜蛋白,其功能是將肝細(xì)胞內(nèi)的膽鹽分泌到毛細(xì)膽管中,是影響膽汁分泌最重要的因素。ABCB11基因突變直接影響到膽鹽輸出泵的表達(dá)量以及功能,與多種膽汁淤積性肝臟疾病相關(guān),在兒科疾病當(dāng)中,以進(jìn)行性家族性肝內(nèi)膽汁淤積癥2型為多見(jiàn)。許多基因突變檢測(cè)技術(shù)目前已被運(yùn)用到臨床進(jìn)行遺傳性疾病的基因診斷,使得進(jìn)行性家族性肝內(nèi)膽汁淤積癥等遺傳代謝性疾病可從嬰兒肝炎綜合征中辨別出來(lái),從而得到確診。目前基因診斷主要是對(duì)疾病的關(guān)聯(lián)基因的編碼外顯子和(或)啟動(dòng)子區(qū)域及其他區(qū)域進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)后將產(chǎn)物用Sanger法直接測(cè)序。直接測(cè)序是突變檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn),但存在著成本高、操作復(fù)雜等問(wèn)題,對(duì)于擁有眾多外顯子的致病基因而言,直接測(cè)序法效率低下、成本高等問(wèn)題顯得尤為突出。因此,創(chuàng)建一種價(jià)格低廉、高效、簡(jiǎn)單方便、而又牢靠的檢測(cè)方法是解決問(wèn)題的關(guān)鍵。高分辨率熔解曲線分析技術(shù)是新近發(fā)展的以價(jià)格低廉、高效簡(jiǎn)便為特點(diǎn)的基因突變檢測(cè)工具,本研究擬建立以高分辨率熔解曲線分析技術(shù)與直接測(cè)序相配合的方法對(duì)膽汁淤積性患兒的ABCB11基因進(jìn)行突變篩查,為臨床基因診斷提供廉價(jià)高效的突變檢測(cè)方法。研究方法：對(duì)20例臨床疑似進(jìn)行性家族性肝內(nèi)膽汁淤積癥2型患兒的ABCB11基因的27個(gè)編碼外顯子及其剪接區(qū)域運(yùn)用高分辨率熔解曲線分析技術(shù)進(jìn)行突變篩查,并測(cè)序驗(yàn)證。測(cè)序結(jié)果運(yùn)用Mutation Taster進(jìn)行分析,新發(fā)現(xiàn)的錯(cuò)義突變用SIFT、PolyPhen-2、SNPsGO進(jìn)行致病性預(yù)測(cè),同時(shí)比較人類與6種哺乳動(dòng)物(黑猩猩、小鼠、大鼠、兔、狗、牛)膽鹽輸出泵蛋白的氨基酸序列,判斷錯(cuò)義突變是否發(fā)生在進(jìn)化保守區(qū)。對(duì)于ABCB11基因上常見(jiàn)的2個(gè)單核苷酸多態(tài)性V444A和A1028A,應(yīng)用高分辨率熔解曲線分析技術(shù)篩查這20例膽汁淤積患兒和200個(gè)正常兒童,分析其是否與膽汁淤積發(fā)病有關(guān)。結(jié)果：在20例患兒中共檢測(cè)到14種變異,包括7種單核苷酸多態(tài)性(rs3815675、rs4148777、rs2287616、rs183390670、rs2287622、rs118109635、 rs497692),6種錯(cuò)義突變(c.1009TC、c.1415AG、C.2086C＞T、c.2792AC、 c.3392AT、c.3593AG)和1種無(wú)義突變(c.2782CT)。其中,錯(cuò)義突變c.1009TC、C.2086C＞T、c.2792AC、c.3392AT、c.3593AG為首次發(fā)現(xiàn)的致病突變。綜合分析臨床資料及突變檢測(cè)結(jié)果,4例患兒可診斷為進(jìn)行性家族性肝內(nèi)膽汁淤積癥2型。V444A和A1028A的等位基因頻率在正常兒童中分別為74.5%、67.2%,在膽汁淤積患兒中分別為80%、75%,膽汁淤積患兒的V444A和A1028A的等位基因頻率與正常兒童比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：對(duì)反復(fù)發(fā)作、黃疸持久不退的膽汁淤積癥患兒有必要做基因診斷。高分辨率熔解曲線分析技術(shù)結(jié)合直接測(cè)序可對(duì)PFIC2患兒進(jìn)行高效廉價(jià)的基因診斷。對(duì)V444A和A1028A的等位基因頻率的篩查表明在正常兒童及膽汁淤積患兒V444A和A1028A多態(tài)性分布無(wú)明顯差異。
[Abstract]:Background and objective: cholestasis is one of the most common phenotype of infant hepatitis syndrome, a variety of causes, including genetic factors caused by various mutations after biliary atresia is the second leading cause of cholestasis. An expression called bile salt export pump membrane protein of human ABCB11 gene encoding, its function is to make bile salt the liver cells secreted into the bile, bile secretion is the most important factor.ABCB11 gene mutation directly affects the expression of bile salt output and pump function, associated with a variety of cholestatic liver disease in the pediatric disease, with progressive familial intrahepatic cholestasis type 2 is rare. Many gene mutation detection technology has been applied to clinical gene diagnosis of hereditary diseases, the progressive familial intrahepatic cholestasis of inherited metabolic diseases from infants Hepatitis syndrome identified, so as to obtain the diagnosis. The genetic diagnosis is mainly related to the disease gene encoding exons and (or) by polymerase chain reaction promoter region and other regions will be characterized by Sanger direct sequencing method. Direct sequencing is the gold standard for mutation detection, but there is a high cost the problems of complicated operation, the pathogenic gene has many exons, direct sequencing of low efficiency, high cost is particularly prominent. Therefore, the creation of a low price, high efficiency, simple and convenient, and reliable detection method is the key to solve the problems of high resolution melting analysis technology is newly developed to low price, simple and efficient for the characteristics of the mutation testing tool, this study intends to establish high resolution melting curve analysis method combined with direct sequencing technology on cholestatic bile Children with ABCB11 gene mutation screening, mutation detection methods provide cheap and efficient for clinical gene diagnosis. Methods: 27 encoding of 20 cases with suspected progressive familial intrahepatic cholestasis in children with type 2 ABCB11 gene exons and splicing region using high resolution analysis technology for mutation screening rate of melting curve, and sequencing. The sequencing results were analyzed by Mutation Taster, the newly discovered missense mutations in SIFT, PolyPhen-2, SNPsGO and pathogenic prediction, and compare the 6 kinds of mammals and humans (chimpanzee, mice, rats, rabbits, dogs, cattle) amino acid sequence of bile salt export pump protein, determine whether missense mutation in the evolutionary conserved region. For the common ABCB11 gene 2 single nucleotide polymorphisms of V444A and A1028A, the application of high resolution melting analysis the screening of 20 cases of bile siltation and 200 children A normal children, and analyze whether it is associated with bile siltation. Results: in 20 patients were detected in 14 variants, including 7 single nucleotide polymorphisms (rs3815675, rs4148777, rs2287616, rs183390670, rs2287622, rs118109635, rs497692), 6 missense mutations (c.1009TC, c.1415AG, C.2086C, T, c.2792AC, c.3392AT 1, c.3593AG) and nonsense mutation (c.2782CT). Among them, missense mutations in c.1009TC, C.2086C, T, c.2792AC, c.3392AT, c.3593AG for the first time found mutations. The mutation and comprehensive analysis of the clinical data of test results, 4 cases of children can be diagnosed as progressive familial intrahepatic cholestasis type 2.V444A and A1028A the allele frequencies in normal children were 74.5%, 67.2%, 80% respectively in cholestasis, with 75% allele frequency in children with normal cholestasis of children with V444A and A1028A were not statistically significant. Theory: recurrent jaundice persistence of cholestasis were necessary for gene diagnosis. High resolution melting curve analysis can be used in gene diagnosis of PFIC2 with high efficiency and low cost technique combined with direct sequencing. The screening of V444A and A1028A allele frequencies showed that in normal children and children with cholestasis V444A and A1028A polymorphism had no significant difference.

【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R725.7;R440

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本文編號(hào)：1659904