本文選題：外力型腦損傷　切入點(diǎn)：發(fā)育期小鼠　出處：《吉林大學(xué)》2016年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：外力型腦創(chuàng)傷(inflicted traumatic brain injury)是一種常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷性疾病,通常發(fā)生在嬰兒3-6個(gè)月齡,具有很高的致死率(10-40%)。近期,據(jù)美國(guó)健康與人類(lèi)服務(wù)部門(mén)報(bào)道,外力型腦創(chuàng)傷已經(jīng)成為嬰兒及青少年兒童蓄意性損傷的首位因素,在0-14歲兒童的嚴(yán)重頭部損傷中列第三位�；颊咂毡榇嬖谘劭萍吧窠�(jīng)癥狀,并且超過(guò)半數(shù)神經(jīng)預(yù)后不佳。早期出現(xiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)問(wèn)題如大腦性麻痹、智力缺陷、失明、癲癇,長(zhǎng)期的隨訪研究表明頭小畸形兒童常常伴有認(rèn)知和主要的行為學(xué)問(wèn)題。蘇格蘭一則前瞻性研究報(bào)道:通過(guò)平均長(zhǎng)達(dá)59個(gè)月的隨訪發(fā)現(xiàn)68%的患兒存在異常發(fā)育,36%的患兒存在嚴(yán)重的認(rèn)知和行動(dòng)困難,致使他們的生活完全依靠父母和看護(hù)者。它給社會(huì)及家庭經(jīng)濟(jì)方面的影響也是巨大的,治療費(fèi)用往往是其他原因造成的顱腦損傷患者的2-3倍。2003年美國(guó)在虐待兒童的直接治療花費(fèi)上就超過(guò)了240億美元。由于此疾病容易被誤診,報(bào)道的發(fā)病率往往比真實(shí)的發(fā)病率低。因此,外力型腦創(chuàng)傷的動(dòng)物模型,尤其是對(duì)旋轉(zhuǎn)加速型腦損傷模型的研究,對(duì)于驗(yàn)證新的假說(shuō),研究新的病理學(xué)機(jī)制和干預(yù)治療方案起到至關(guān)重要的作用。很不幸的是,這種特殊性創(chuàng)傷性腦損傷的動(dòng)物模型沒(méi)有被很好的發(fā)展。在此項(xiàng)研究中我們介紹了一種新的動(dòng)物模型來(lái)產(chǎn)生旋轉(zhuǎn)加速損傷。第一部分外力型腦創(chuàng)傷動(dòng)物模型的建立實(shí)驗(yàn)?zāi)康?建立外力型腦創(chuàng)傷動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)方法:(1)動(dòng)物模型建立:建立旋轉(zhuǎn)加速型發(fā)育期小鼠腦損傷模型從而模擬臨床常見(jiàn)嬰幼兒創(chuàng)傷型腦損傷。從每窩抓取偶數(shù)個(gè)生后12天(P12)的C57BL/6的小鼠,并且按體重配對(duì)分為損傷組和對(duì)照組。將P12小鼠放入含有3%異氟烷并用100%氧氣蒸發(fā)的的麻醉盒中,麻醉完畢后把小鼠俯臥位置于平板上,用橡皮筋將頭部牢固的固定于頭架中,頭架被氣泵敲擊后發(fā)生轉(zhuǎn)動(dòng),旋轉(zhuǎn)加速的速度和角度可以通過(guò)氣壓和移動(dòng)活塞的距離來(lái)調(diào)節(jié),每次造模的過(guò)程可以描述為60psi氣泵擊打活塞60、80、100次,每次旋轉(zhuǎn)的角度為過(guò)屈35°過(guò)伸25°。在操作結(jié)束后統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的死亡率。(2)意識(shí)狀態(tài)的評(píng)估:翻正反射(righting reflex):亦稱(chēng)復(fù)位反射。一般指動(dòng)物處于異常體位時(shí)產(chǎn)生的恢復(fù)正常體位的反射。動(dòng)物首先是頭部恢復(fù)正常位置,這是由于迷路感受引起的,反射中樞在中腦。這時(shí)軀干依然處于不正常位置時(shí),就發(fā)生頸肌扭曲,于是其刺激就發(fā)出使軀干恢復(fù)正位的第二反射。采用翻正反射來(lái)評(píng)估小鼠麻醉后恢復(fù)到清醒意識(shí)狀態(tài)的時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:(1)與SHAM組相比,在60psi下無(wú)論是60、80或100次旋轉(zhuǎn)加速過(guò)程中,i TBI組小鼠均出現(xiàn)了呼吸暫停,口唇粘膜發(fā)紺的缺氧現(xiàn)象,在100次旋轉(zhuǎn)加速操作后i TBI組小鼠的生存率達(dá)79%。(2)翻正反射結(jié)果顯示:SHAM組小鼠從麻醉狀態(tài)恢復(fù)到清醒意識(shí)的平均時(shí)間為83秒,在60psi下在60、80和100次旋轉(zhuǎn)加速后i TBI組小鼠從麻醉狀態(tài)恢復(fù)到清醒意識(shí)的平均時(shí)間分別為181±43.1秒、266±23.8秒、328±35.7秒,呈階梯狀遞增。結(jié)論:本研究成功建立了旋轉(zhuǎn)加速型發(fā)育期小鼠外力型腦損傷模型。第二部分發(fā)育期小鼠外力型腦創(chuàng)傷后的生理學(xué)及神經(jīng)病理學(xué)改變實(shí)驗(yàn)?zāi)康?探討發(fā)育期小鼠在外力型腦創(chuàng)后的神經(jīng)病理學(xué)及生理學(xué)改變實(shí)驗(yàn)方法:(1)生命體征檢測(cè):完成旋轉(zhuǎn)加速操作后的小鼠置于俯臥位,將感應(yīng)器夾在小鼠大腿跟部,由Mouse Ox TM Oximeter(STARR Life Sci.Corp.)監(jiān)測(cè)損傷后動(dòng)物的心肺功能和血氧飽和度,并由計(jì)算機(jī)模擬數(shù)據(jù)系統(tǒng)與Win Daq數(shù)據(jù)獲取系統(tǒng)連接進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。(2)腦損傷評(píng)估:損傷后的小鼠去頂骨后,肉眼觀察其硬腦膜及蛛網(wǎng)膜下是否發(fā)生出血或水腫;通過(guò)Evans Blue法測(cè)量血腦屏障滲透性;通過(guò)測(cè)量大腦的濕/干比重從而確認(rèn)損傷后的腦水腫情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:(1)生命體征檢測(cè):在60psi,60次旋轉(zhuǎn)加速的致傷作用下,所有i TBI組小鼠均出現(xiàn)了不規(guī)則的呼吸,一些出現(xiàn)了中樞性呼吸暫停。與SHAM組小鼠相比,i TBI組小鼠的呼吸頻率、心率、血氧飽和度受到了嚴(yán)重的影響。(2)i TBI組小鼠在不同的致傷條件作用下(15psi,30次;30psi,30次;60psi,30次;60psi,60次;60psi,100次)硬腦膜及蛛網(wǎng)膜下均可肉眼觀察到出血癥狀;在60psi,60次的致傷作用下,損傷7小時(shí)后,與SHAM相比,在610nm波長(zhǎng)處i TBI組鼠腦中Evans Blue溶液質(zhì)量增加,存在顯著差異(P0.05,n=5),表明了血腦屏障的通透性增高;在60psi,60次的致傷作用下,損傷7小時(shí)后,i TBI組小鼠腦的濕/干比5.05±0.24g/g,SHAM組小鼠腦的濕/干比4.74±0.15g/g,差別具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05,n=5),表明了損傷7小時(shí)后急性腦水腫的發(fā)生。結(jié)論:外力型腦創(chuàng)傷可導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)短暫的心肺功能失常及生命體征變化,包括心動(dòng)過(guò)緩、出現(xiàn)呼吸暫停癥狀,血氧飽和度下降;血腦屏障完整性發(fā)生破壞,腦間質(zhì)滲透性增強(qiáng),并出現(xiàn)腦水腫。第三部分發(fā)育期小鼠外力型腦創(chuàng)傷的行為學(xué)變化實(shí)驗(yàn)?zāi)康?探討發(fā)育期小鼠在外力型腦創(chuàng)后是否發(fā)生運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知能力的改變實(shí)驗(yàn)方法:(1)動(dòng)物行為學(xué)測(cè)試:采用旋轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)法(Rotarod test)分別在傷后不同的觀察點(diǎn)(傷后9天、19天、30天)對(duì)腦損傷后雄性小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)價(jià),以觀察腦損傷后小鼠運(yùn)動(dòng)功能及協(xié)調(diào)性的恢復(fù)情況;采用Y迷宮實(shí)驗(yàn)(Y maze test)分別在不同的觀察點(diǎn)(傷后14天、21天、28天)對(duì)腦損傷后小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)價(jià),以觀察腦損傷后小鼠辨別性學(xué)習(xí)和記憶能力的恢復(fù)情況。(2)分子表達(dá):動(dòng)物模型完成后(60psi,60次)在傷后第3天(3dpi)收集,SHAM組/i TBI組新鮮腦組織,應(yīng)用蛋白定量分析法觀察膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)及白細(xì)胞介素-6(IL-6)、小膠質(zhì)細(xì)胞特異性抗體Aba I表達(dá)情況,以觀察促炎介質(zhì)及星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)對(duì)早期動(dòng)物行為學(xué)的影響。(3)神經(jīng)元損傷評(píng)估:動(dòng)物模型完成后(60psi,60次)在傷后第42天(42dpi)收集,SHAM組/i TBI組腦組織固定于4%多聚甲醛中,通過(guò)20%蔗糖脫水、冰凍包埋處理后,進(jìn)行冰凍切片并浸于4%多聚甲醛中7天后進(jìn)行腦片銀染,在形態(tài)學(xué)上觀察神經(jīng)元損傷對(duì)遠(yuǎn)期動(dòng)物行為學(xué)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:(1)兩組動(dòng)物的旋轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)法(Rotarod test)結(jié)果顯示:從傷后第9天至傷后第30天兩組動(dòng)物的評(píng)分值呈逐步上升趨勢(shì)。傷后第9天,SHAM組/i TBI組=81.37s/50.16s,差別具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),傷后第19天,SHAM組/i TBI組=109.12s/129.2s,差別無(wú)顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,傷后第30天,SHAM組/i TBI組=120.36s/148.96s,差別無(wú)顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;Y迷宮實(shí)驗(yàn)(Y maze test)結(jié)果顯示:從傷后第14天到傷后第28天,SHAM組評(píng)分值無(wú)明顯差異,i TBI組在傷后第28天評(píng)分值明顯下降,傷后第14天,SHAM組/i TBI組=0.59/0.58,傷后第21天,SHAM組/i TBI組=0.55/0.6,傷后第28天,SHAM組/i TBI組=0.56/0.41,差別具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(2)Western blot結(jié)果顯示:傷后第3天,i TBI組小鼠腦組織中膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)及白細(xì)胞介素-6(IL-6)、小膠質(zhì)細(xì)胞特異性抗體Aba I水平出現(xiàn)明顯升高,和SHAM相比差別具有顯著的差異(P0.05)。(3)銀染結(jié)果顯示:傷后第30天,i TBI組小鼠腦組織第一運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)區(qū)(M1區(qū))第一前肢功能軀體感覺(jué)皮質(zhì)區(qū)(S1FL區(qū)),及基底前腦(BF區(qū))出現(xiàn)黑色點(diǎn)狀染色,提示這些區(qū)域的神經(jīng)元胞體及軸突的退行性變。結(jié)論:外力型腦創(chuàng)傷對(duì)小鼠發(fā)育未成年時(shí)期運(yùn)動(dòng)功能及協(xié)調(diào)性具有顯著的影響,但在發(fā)育后期已接近正常水平。盡管如此,對(duì)于探知功能的影響則出現(xiàn)在發(fā)育成年階段,綜上結(jié)果表明了外力型腦創(chuàng)傷可以導(dǎo)致發(fā)育期小鼠大腦的運(yùn)動(dòng)功能、協(xié)調(diào)性和辨別性學(xué)習(xí)和記憶能力缺陷;并且可導(dǎo)致發(fā)育期小鼠損傷早期的炎癥反應(yīng)、小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞增生及發(fā)育后期神經(jīng)退行性變,這可能也是導(dǎo)致小鼠功能發(fā)生變化的主要因素。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R726.5

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本文編號(hào)：1643524