本文關鍵詞： 青少年特發(fā)性脊柱側凸 全基因組關聯分析 單核苷酸多態(tài)性 遺傳學 易感基因 青少年特發(fā)性脊柱側凸 LBX1 Wnt/β-catenin信號通路 病因學 青少年特發(fā)性脊柱側凸 GPR126 單核苷酸多態(tài)性 遺傳學 病因 青少年特發(fā)性脊柱側凸　出處：《南京大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：第二章(第一節(jié))全基因組關聯分析定位漢族AIS致病新基因目的本研究在既往全基因組關聯分析(Genome-wide association study,GWAS)研究的基礎上,進一步增加病例量和健康對照量,尋找新的中國漢族人群青少年特發(fā)性脊柱側凸(Adolescent idiopathic scoliosis,AIS)相關的單核苷酸多態(tài)性位點(Single nucleotide polymorphism,SNP),定位易感基因,探究AIS發(fā)病的機制。方法納入2009-2016年于中國南京、香港、杭州、長春等地就診并采集血樣的AIS患者5201例和健康對照6787例。從全血提取基因組DNA,使用Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array 6.0芯片進行基因分型及全基因組關聯分析,通過三階段實驗篩選出AIS相關的SNPs,進一步定位易感基因和致病信號通路。使用PLINK軟件計算最小等位基因頻率、檢驗Hardy-weinberg平衡,使用EIGENSTRAT軟件進行群體分層分析,使用Haploview軟件進行病例-對照關聯分析。全基因組顯著性差異P值定位5 x10-8。結果群體分層分析結果顯示AIS組及對照組均來自中國漢族人群,基因組膨脹系數為1.13,無明顯群體分層現象。經過質量控制后,共有435183個SNPs納入統(tǒng)計學分析,第一階段的病例-對照關聯分析納入1456例AIS和2104例正常對照。第一階段篩選出56個潛在陽性的SNPs位點,剔除連鎖位點和既往已報道的位點,剩余24個SNPs位點進行驗證實驗。經過兩個階段的驗證實驗,最終篩選出4個AIS顯著相關的SNPs,包括2p14上的rs7593846,3p14.1上的rs7633294,3q26.2 上的 rs9810566 和 20p11.22 上的 rs6047663,這 4 個 SNPs 所在區(qū)域內對應的基因分別為MEIS1、MAGI1、TNIK和PAX1。結論本研究發(fā)現了新的中國漢族人群AIS易感位點,包括2p14的rs7593846,3p14.1 的 rs7633294,3q26.2 的 rs9810566,此外,還發(fā)現一個 AIS 易感位點rs6047663位于20p11.22,該區(qū)域與既往白種人AIS的GWAS研究結果一致。通過這些位點進一步定位了一批AIS易感基因:MEIS1、MAGI1、TNIK和PAX1,其中的TNIK、MEIS1、MAGI1,以及既往GWAS研究發(fā)現的LBX1、PAX3等基因與Wnt/β-catenin信號通路密切相關,以上基因及信號通路的發(fā)現對今后中國漢族人群AIS的發(fā)病機制的研究具有重要意義。第二章(第二節(jié))Wnt/β-catenin信號通路在青少年特發(fā)性脊柱側凸發(fā)病機制中的研究目的我們前期基于大樣本的全基因組關聯研究發(fā)現的一系列AIS易感基因如LBX1、PAX3、TNIK和MEIS1等,均位于Wnt/β-catenin信號通路下游。然而AIS患者這些基因表達是否存在異常,其受何種調控因素影響等仍然未知。本研究旨在探究Wnt/β-catenin信號通路下游各基因在AIS發(fā)病中的作用。方法共入選124名行后路矯形內固定手術的AIS漢族女性患者,手術取頂椎區(qū)椎旁肌組織。對照組1由20名Chiari畸形伴脊柱側凸的女性患者組成,手術取頂椎區(qū)椎旁肌組織。對照組2由24名非脊柱畸形的女性患者組成,手術取L5兩側椎旁肌組織。從肌肉中提取RNA和蛋白,通過實時熒光定量PCR技術和Western Blot 技術檢測β-catenin、TNIK、TCF4、PAX3、LBX1、MyoD、MEIS1、PAX1的表達,比較實驗組和對照組之間、凹凸側間的表達差異,分析各基因之間的相關性。取AIS病人凹凸側椎旁肌行肌球蛋白ATP酶染色,免疫熒光檢測Ⅰ、Ⅱ型肌纖維與MyoD的表達,比較凹凸側Ⅰ、Ⅱ型肌纖維的百分比,并分析Ⅰ型肌纖維凹凸側比與MyoD表達水平之間的相關性。結果三組對象年齡匹配,AIS組與Chiari畸形組Cobb角匹配。mRNA水平:AIS 組 β-catenin、TNIK、TCF4、PAX3、LBX1、MyoD、MEIS1、PAX1 的表達均低于對照組,且AIS組凹凸側之間存在顯著差異,均表現為凹側小于凸側,而對照組兩側無差異。此外,通路中大多數基因之間呈顯著正相關。蛋白水平:AIS組β-catenin和LBX1的表達凹側小于凸側,且凹側小于對照組。AIS病人頂椎區(qū)凹側椎旁肌I型肌纖維比例顯著低于凸側(49.5%±8.0%vs.61.5%±7.7%,p=0.002),Ⅰ型肌纖維凹凸側比與椎旁肌MyoD表達顯著相關(r=0.67,p=0.02)。結論β-catenin,TNIK、LBX1、MyoD等基因在AIS患者雙側椎旁肌之間表達存在顯著差異,且MyoD的表達與凹凸側肌纖維比例異常相關。本研究首次揭示了 Wnt/β-catenin信號通路與AIS發(fā)病的潛在關系,對AIS發(fā)病機制的研究具有重要意義。第二章(第三節(jié))GPR126基因多態(tài)性與青少年特發(fā)性脊柱側凸關聯分析及功能研究目的探討GPR126基因多態(tài)性位點rs9403380與青少年特發(fā)性脊柱側凸(AIS)發(fā)病的相關性,進一步分析rs9403380是否為GPR126基因的功能性調控位點。方法共入選975例AIS患者(135男,840女)和1049例正常青少年對照(151男,898女),收集其血樣和影像學資料。從全血中提取DNA,通過Taqman探針對rs9403380位點進行基因分型,比較不同基因型和等位基因在AIS組與對照組之間的分布差異。手術取48例AIS患者頂椎區(qū)椎旁肌組織和10例青少年腰椎間盤突出患者L5兩側椎旁肌組織及血樣本,從肌肉中提取RNA和蛋白,通過實時熒光定量PCR技術和Western Blot技術檢測GPR126的表達,比較AIS組與對照組GPR126基因的表達情況,進一步分析rs9403380位點不同基因型的AIS患者GPR126的表達是否存在差異。結果AIS組GPR126基因rs9403380位點的基因型及等位基因分布與對照組比較有顯著差異(p=0.005和0.001),其等位基因C為風險基因(OR=1.16,95%CI=1.05-1.27)。椎旁肌GPR126表達AIS組顯著高于對照組(p0.001),風險基因型CC的AIS患者的GPR126表達顯著高于基因型TT的AIS患者(p=0.011)。結論GPR126基因多態(tài)性位點rs9403380與AIS發(fā)生相關,該位點為GPR126基因的功能性調控位點。第三章(第一節(jié))青少年特發(fā)型脊柱側凸前柱過度生長:原發(fā)還是繼發(fā)?目的應用多層螺旋CT多平面重建技術(Multiple Planar Reconstruction,MPR)測量青少年特發(fā)性脊柱側凸(AIS)患者的椎體形態(tài),并與Chiari畸形I型(Chiari I malformation CMI)伴脊柱側凸患者及健康青少年的椎體形態(tài)測量結果相比較,探究AIS患者是否存在前后柱異常發(fā)育,進一步分析該現象為AIS發(fā)病的原發(fā)因素還是繼發(fā)因素。方法納入60例AIS Lenke I型患者(AIS組),52例年齡、性別和Cobb角相匹配的Chiari畸形伴胸彎患者(Chiari組),30例年齡、性別相匹配健康青少年志愿者(對照組)。對入選對象進行多層螺旋CT胸椎掃描,采用3D-MPR技術測量胸椎椎體的各項參數,包括椎體前緣高度、后緣高度、椎體中心橫徑,椎弓根高度等,并用椎體前緣高度比上椎弓根高度代表前后柱高度比,比較三組各參數之間的差異。結果AIS組與Chiari組的T2-T12節(jié)段椎體前緣高度均顯著大于對照組,T1-T12各節(jié)段椎體后緣高度均顯著大于對照組,AIS組T4-T10節(jié)段、Chiari組T6-T10節(jié)段椎弓根高度顯著小于對照組,但AIS組與Chiari組各參數之間無顯著差異。三組椎體中心橫徑無顯著差異。椎體前緣高度或椎體后緣高度比上椎弓根高度,AIS組與Chiari組均顯著大于對照組,兩組間無顯著差異。結論與正常對照相比,AIS組與Chiari組均表現為前柱過度生長,且兩組之間無顯著差異,兩組前柱過度生長可能有相同的發(fā)病因素。因此,AIS患者前柱過度生長可能是AIS發(fā)病的繼發(fā)因素。第三章(第二節(jié))Lenke 1A型青少年特發(fā)性脊柱側彎遠端融合椎的選擇目的既往研究表明選擇遠端觸及椎(last touching vertebra,LTV)作為青少年特發(fā)性脊柱側彎(adolescent idiopathic scoliosis,AIS)矯形術的遠端融合椎(lowest instrumented vertebra,LIV)可獲得較好的效果并保留更多的運動節(jié)段。本研究將LTV進一步分為充分觸及椎(Substantially Touched Vertebra,STV)與非充分觸及椎(non-Substantially Touched Vertebra,nSTV),比較選擇不同的 LIV(nSTV,nSTV+1,STV)對Lenke1A型AIS患者后路選擇性內固定融合療效的影響,并分析與術后遠端附加現象(adding-on)發(fā)生相關的因素。方法納入104例自2006年7月至2012年7月在我院診斷為Lenke 1型AIS患者,行后路選擇性融合手術并至少隨訪兩年。STV定義為骶正中線位于兩側椎弓根之間或穿過一側椎弓根的觸及椎;nSTV定義為骶正中線位于椎弓根邊緣與同側椎體邊緣之間的觸及椎。依據LIV選擇的不同將病人分為nSTV,nSTV+1與STV三組,比較三組術前、術后和末次隨訪時的影像學參數,并進一步分析與術后adding-on發(fā)生的相關因素。結果在末次隨訪時,共有23例患者(22.1%)發(fā)生adding-on。nSTV組adding-on發(fā)生率顯著高于 STV組(66.7%vs.10.0%,P0.01)與nSTV+1 組(66.7%vs.11.6%,P0.01)。與adding-on發(fā)生相關因素包括:LIV與STV/nSTV+1之間相差節(jié)段數,術前上胸彎度數與矢狀面平衡(SVA),術后腰彎度數、頂椎偏移距離、軀干偏移距離和影像學雙肩高度差。進一步通過邏輯回歸分析確定與adding-on發(fā)生相關因素為:LIV與STV/nSTV+1之間相差節(jié)段數(LIV-STV0或LIV-(nSTV+1)0,OR=27.1,95%CI=2.3-311.2,P=0.002)。結論將LTV劃分為STV與nSTV有助于LIV的選擇。LIV與STV/nSTV+1之間相差節(jié)段數與術后adding-on的發(fā)生密切相關。選擇STV或nSTV+1作為LIV可減少術后adding-on的發(fā)生,使Lenke1型AIS患者獲得良好的矯形效果。
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【學位授予單位】：南京大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R726.8

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