本文關鍵詞：p66Shc特異性慢病毒載體的構建及其對高氧誘導肺泡上皮細胞凋亡的影響

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【摘要】：目的：構建p66Shc特異性慢病毒載體,穩(wěn)定轉染至人肺泡Ⅱ型上皮A549細胞中，抑制p66Shc的表達，并探討其對高氧誘導肺泡上細胞凋亡的影響。 方法：設計3條p66ShcRNA干擾靶點，合成雙鏈DNA，與雙酶切后的慢病毒空載體進行連接，轉化入感受態(tài)的細胞，鑒定陽性克隆正確后，抽提、擴增質粒，與另外3個輔助包裝質粒進行慢病毒包裝，測定滴度后感染A549細胞，，選取沉默效應最為明顯的p66Shc-Shc1組進入后續(xù)實驗，穩(wěn)定培養(yǎng)一個月。同時體外傳代培養(yǎng)慢病毒空載體感染的A549細胞及未做任何處理的A549細胞。將實驗細胞分為四組：對照組，高氧組，慢病毒+高氧組，空載體+高氧組。對照組：在含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的1640培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)；高氧組、慢病毒+高氧組、空載體+高氧組：加入等量的上述培養(yǎng)液，換液后，以3L/min的速度通入含95%氧氣的高純混合氣10min，后在培養(yǎng)箱中密閉培養(yǎng)。培養(yǎng)結束后收集細胞檢測指標:倒置相差顯微鏡下觀察A549細胞的形態(tài)學改變；流式細胞術檢測高氧及慢病毒載體對細胞凋亡的影響；SP細胞免疫化學方法檢測分組24小時后XIAP，Caspase-9蛋白的表達；激光共聚焦顯微鏡檢測線粒體活性氧產生情況及膜電位變化情況。 結果：（1）p66Shc-pLenR-GPH載體的鑒定：將重組質粒及pLenR-GPH空載體以限制性內切酶雙酶切后行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結果與預期相符，LV-shRNA載體構建成功。（2）慢病毒的包裝：將所構建的p66Shc-pLenR-GPH重組質粒及pLenR-GPH空載體與輔助包裝質粒pRsv-REV， pMDlg-pRRE，pMD2G共轉染293T細胞，轉染終止24小時后在熒光倒置顯微鏡下觀察，每孔細胞均表達GFP綠色熒光，轉染成功。（3）穩(wěn)定沉默p66Shc基因的A549細胞系的建立：將濃縮后的病毒感染A549細胞，對感染后的A549細胞做熒光定量PCR及Western blot，3組細胞p66ShcRNA表達量降低，p66Shc蛋白的表達下降，p66Shc-Shc1組下降更為明顯，表明我們已經成功建立了穩(wěn)定沉默p66Shc的A549細胞系，并選取p66Shc-Shc1組進入后續(xù)實驗。（4）倒置相差顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)學改變:對照組細胞貼壁良好，呈鋪路石樣，為典型扁圓多角形，數(shù)量多，排列緊密，懸浮細胞少。高氧組及空載體+高氧組細胞隨時間延長，懸浮細胞數(shù)量增多，貼壁細胞生長緩慢，細胞形態(tài)由典型的扁圓多角形變成圓形或橢圓形，數(shù)量減少，連接松散，細胞間隙可見較多細胞碎片。慢病毒+高氧組細胞生長狀態(tài)欠佳，部分細胞形態(tài)由典型的扁圓多角形變成圓形或橢圓形，活細胞數(shù)量較高氧組增多，懸浮細胞數(shù)量較高氧組少，但未達到對照組水平；（5）流式細胞術檢測凋亡:與對照組相比，高氧組及空載體+高氧組細胞凋亡率明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。而慢病毒+高氧組的凋亡率有所降低，與高氧組比較差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)；（6）免疫組織化學方法檢測凋亡相關蛋白的表達：與對照組相比，高氧組及空載體+高氧組細胞內XIAP表達減少，Caspase-9蛋白的表達明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。而與高氧組相比，慢病毒+高氧組細胞內XIAP表達增加，Caspase-9蛋白的表達有明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)；（7）激光共聚焦顯微鏡結果：與對照組相比，高氧組細胞線粒體活性氧含量顯著增加，膜電位明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。而與高氧組相比，慢病毒+高氧組細胞線粒體活性氧含量顯著減少，膜電位明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)，但未達到對照組水平(p0.05)。 結論：高氧誘導細胞內p66Shc出現(xiàn)高表達，發(fā)生磷酸化，轉位于線粒體，線粒體活性氧產生增多，膜電位下降。靶向表達p66Shc的shRNA慢病毒載體，轉染入人肺泡Ⅱ型上皮A549細胞內，可通過RNA干擾導致p66Shc基因沉默，減少線粒體活性氧產生，減輕膜電位下降，減少A549細胞凋亡，減輕肺泡上皮細胞的損傷。而慢病毒空載體組則沒有這種變化。
【學位授予單位】：瀘州醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R722.6

【參考文獻】

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1 車忠麗;董文斌;李清平;雷小平;康蘭;郭琳;翟雪松;陳楓;;PKCβ/p66Shc氧化應激通路介導高氧誘導人肺泡上皮細胞凋亡的作用[J];臨床兒科雜志;2013年11期

本文編號：1298370