發(fā)布時(shí)間：2017-11-14 00:22

  本文關(guān)鍵詞：小兒腎母細(xì)胞瘤血清創(chuàng)傷應(yīng)激相關(guān)因子的篩選與鑒定

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【摘要】：研究背景 腎母細(xì)胞瘤(Wilms tumor)又稱(chēng)腎胚胎瘤(embryonic tumor of kidney),又稱(chēng)Wilms瘤(WT),是小兒中最常見(jiàn)的腹膜后的惡性實(shí)質(zhì)性腫瘤之一,其發(fā)病率于小兒腹部實(shí)體腫瘤中占第一位,特別是在15歲以下的小兒泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤中占有很大比例,占80%以上,主要發(fā)生在生后前5年內(nèi),2-4歲多見(jiàn)。左右兩側(cè)發(fā)病率幾乎相同,但是雙側(cè)腫瘤同時(shí)發(fā)病比較少,其約占腎母細(xì)胞瘤總發(fā)病率的3-10%,相繼或同時(shí)發(fā)生。男女性患兒的發(fā)病率幾乎無(wú)差別,但是有很多研究表明男性患兒發(fā)病率略高于女性患兒。目前為止大家認(rèn)為分型及分期是影響患兒預(yù)后的主要因素,與腫瘤具體大小無(wú)明顯關(guān)系。早期的診斷對(duì)于腎母細(xì)胞瘤的治療方式以及患兒治療后的效果具有重要意義。腎母細(xì)胞瘤患兒的早期臨床表現(xiàn)不明顯,而且因?yàn)槠浒l(fā)病年齡較低,患者多數(shù)為小兒或嬰兒,容易受家長(zhǎng)或醫(yī)生的忽視而導(dǎo)致其就醫(yī)時(shí)間延遲,診斷明確延遲。目前的檢查方法主要是：超聲檢查、CT及磁共振及排泄性尿路造影(IVU)等,并結(jié)合臨床診斷,才能基本確定腎母細(xì)胞瘤,而明確診斷要靠病理診斷,病理診斷是檢查的金標(biāo)準(zhǔn),理想的早期診斷手段正在探索中。目前運(yùn)用于腎母細(xì)胞瘤血液檢查初步診斷的相關(guān)性標(biāo)記物的敏感性和特異性都比較差,診斷價(jià)值有限。上述各種相關(guān)情況決定了現(xiàn)無(wú)論在手術(shù)還是化療、放射治療抑或生物治療上,對(duì)中晚期的。腎母細(xì)胞瘤患兒的治療是臨床上的重點(diǎn),如此也必然會(huì)直接影響到治療后的效果。據(jù)了解美國(guó)國(guó)家腎母細(xì)胞瘤研究協(xié)作組研究表明,與治療方法無(wú)關(guān),腎母細(xì)胞瘤患兒的生存率是隨著腫瘤分期的升高而下降,故中晚期患兒面臨巨大的死亡風(fēng)險(xiǎn)。由此我們可以看出,依靠現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)技術(shù)找尋一種簡(jiǎn)便、易行、準(zhǔn)確的早期檢測(cè)方法檢測(cè)小兒腫瘤以使腎母細(xì)胞瘤患兒能夠得到早期診斷而更早的治療并獲得長(zhǎng)期生存率是現(xiàn)在小兒外科醫(yī)學(xué)迫切要求的。 最早于1994年蛋白質(zhì)組學(xué)這一概念被提出后就獲得了大量的認(rèn)可和研究。本質(zhì)上是指在大規(guī)模的水平上通過(guò)特殊方法研究蛋白質(zhì)的特征。無(wú)論是量還是質(zhì)的變化,任何的疾病、任何機(jī)體活動(dòng)在蛋白質(zhì)水平上都會(huì)發(fā)生改變。因此我們可以根據(jù)蛋白質(zhì)水平變化建種以監(jiān)測(cè)某種疾病的特異性蛋白質(zhì)水平量或質(zhì)的變化以達(dá)到對(duì)該種疾病早期診斷的目的的診斷系統(tǒng),這也是現(xiàn)在臨床醫(yī)生和科研工作者對(duì)于疾病,特別是腫瘤的早期診斷的一個(gè)特殊的重要的研究方向。而找尋對(duì)應(yīng)某種疾病發(fā)生發(fā)展的特異性蛋白質(zhì)則成了研究的核心問(wèn)題。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)的更新發(fā)展,許多疾病蛋白質(zhì)標(biāo)記物被檢測(cè)出并鑒定。在藥物目標(biāo)靶點(diǎn)和疾病特異蛋白質(zhì)標(biāo)記物篩選中應(yīng)用蛋白組學(xué)的研究方法被人們認(rèn)為是最有效果和便捷的方法之一,由此我們可以看出,該相關(guān)技術(shù)為尋找準(zhǔn)確簡(jiǎn)便可行的腎母細(xì)胞瘤篩查和早期檢測(cè)手段提供了一種可能。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可快速高通量的篩查檢測(cè)疾病發(fā)生的不同階段基因表達(dá)的蛋白質(zhì)表達(dá)情況,從而檢測(cè)到有診斷意義的特異蛋白質(zhì)標(biāo)記分子,而這些高表達(dá)的特異蛋白能為早期診斷提供依據(jù),也可能為疾病的治療提供靶點(diǎn),將有望更好地服務(wù)于臨床。2002年科研工作者發(fā)明了表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀器(SELDI-TOF-MS),蛋白質(zhì)芯片技術(shù)由此已廣泛用于各類(lèi)疾病特異性蛋白標(biāo)志物的篩選及檢測(cè),在不斷發(fā)展中取得了一系列突破性研究進(jìn)展。該研究方法有許多優(yōu)點(diǎn),其靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、快速高通量、樣品用量小,通過(guò)結(jié)合LC-MS/MS、 MALDI-TOF-MS等新技術(shù)已經(jīng)鑒定出了諸多腫瘤如乳腺癌、肝癌、胰腺癌等腫瘤血清中的特異性蛋白質(zhì)。 本研究是應(yīng)用SELDI技術(shù)檢測(cè)腎母細(xì)胞瘤患兒病例血清、創(chuàng)傷應(yīng)激患兒血清及正常小兒血清中的蛋白,篩選出特異性高表達(dá)的蛋白質(zhì),并應(yīng)用質(zhì)譜相關(guān)技術(shù)對(duì)篩選出的特異性蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定,找出創(chuàng)傷應(yīng)激相關(guān)因子,從而兩者共同構(gòu)成腎母細(xì)胞瘤創(chuàng)傷和非創(chuàng)傷性的蛋白標(biāo)記物。在應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)幾項(xiàng)重要技術(shù)基礎(chǔ)上,包括SELDI MALDI SPE、HPLC與LC-MS的串聯(lián)使用,通過(guò)對(duì)腎母細(xì)胞瘤患兒的病例血清、創(chuàng)傷應(yīng)激患兒血清及正常小兒血清中對(duì)蛋白質(zhì)定性定量比較分析,篩選并鑒定腎母細(xì)胞瘤患兒和創(chuàng)傷應(yīng)激患兒血清中特異性高表達(dá)的蛋白質(zhì),此特異性蛋白質(zhì)標(biāo)記物為對(duì)前期篩選的腎母細(xì)胞瘤特異標(biāo)志物的其他蛋白區(qū)分干擾及進(jìn)一步驗(yàn)證提供了參考和意見(jiàn)。在前期工作中,我們付出了很大努力找出了許多相關(guān)特異性標(biāo)記物,得到前期成果m／z為6438的特異性標(biāo)記物,鑒定為載脂蛋白C-I,但是,由于腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中產(chǎn)生的壓迫周?chē)M織或出血等創(chuàng)傷作用可產(chǎn)生一定的相關(guān)因子,同時(shí)患兒本身其他疾病及癌組織或癌旁組織能產(chǎn)生某些非特異或含量較少的蛋白或物質(zhì),使腫瘤患者血清中的篩查出的特異蛋白質(zhì)在質(zhì)和量上無(wú)法區(qū)分于某些創(chuàng)傷應(yīng)激性患兒或良性疾病患兒。創(chuàng)傷應(yīng)激性疾病與腎母細(xì)胞瘤病例表達(dá)的蛋白質(zhì)可能存在著一定的相關(guān)性。由于炎癥及創(chuàng)傷氧化應(yīng)激對(duì)腫瘤患者血清蛋白質(zhì)的質(zhì)和量上的干擾,產(chǎn)生許許多多種類(lèi)的相關(guān)蛋白質(zhì),則會(huì)使前期成果原已被鑒定為特異性蛋白標(biāo)志物的可信度和應(yīng)用性大大降低,因?yàn)槊庖呦到y(tǒng)和體內(nèi)氧化還原系統(tǒng)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著關(guān)鍵作用導(dǎo)致了有某些混雜入腎母細(xì)胞瘤血液的蛋白質(zhì)同樣被檢測(cè)。所以本次篩選腎母細(xì)胞瘤特異性蛋白質(zhì)標(biāo)記物的工作中,我們將在腫瘤血清中找尋創(chuàng)傷應(yīng)激相關(guān)的特殊蛋白或物質(zhì),與非創(chuàng)傷性特異標(biāo)記物相鑒別并共同構(gòu)建完善的指紋圖譜模型。 研究目的 篩選并鑒定小兒腎母細(xì)胞瘤血清創(chuàng)傷應(yīng)激相關(guān)因子,與非創(chuàng)傷應(yīng)激性蛋白標(biāo)記物相鑒別,為研究腎母細(xì)胞瘤血清早期診斷和預(yù)后監(jiān)測(cè)的特異蛋白標(biāo)志物的價(jià)值和前景打下基礎(chǔ)。 材料與方法 1.1血清樣本收集和處理 本課題所選取的血清樣本均來(lái)源于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院小兒外科,包括61例腎母細(xì)胞瘤患兒(預(yù)后良好型)術(shù)前血清樣本(Ⅰ stage28, Ⅱ stage18, Ⅲ stage12and IV stage3(分期依據(jù)NWTS-5標(biāo)準(zhǔn))；34例創(chuàng)傷應(yīng)激患兒血清樣本,血清收集時(shí)間為患兒受車(chē)禍等事故創(chuàng)傷1-3天內(nèi)；60例正常對(duì)照小兒血清來(lái)源于體檢小兒。腎母細(xì)胞瘤患兒術(shù)前血清組、正�；純貉褰M及創(chuàng)傷患兒血清組均于外周靜脈全血標(biāo)本清晨空腹時(shí)抽取,在4℃下靜置1-2h后,3000r／min離心15min,取血清,分別編號(hào)分管分開(kāi)-80。C冰箱中保存。 1.2血清差異蛋白篩選 SELDI-TOF：腎母細(xì)胞瘤患兒血清組和對(duì)照組血清在冰浴上緩慢融解(30-60分鐘),融解后4。C離心10000rpmx5min,取5μL血清,加入10μlU9血清處理液中,4。C的條件下?lián)u床上振蕩使其充分混合(600rpmx30min):用Binding Buffer將U9處理后的血清稀釋至200μl,4℃搖床上振蕩使充分混合(600rpmx2min)后用于WCX2蛋白芯片上樣。首先應(yīng)用已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白芯片All-in-One將SELDI質(zhì)譜系統(tǒng)的分子量誤差校正至0.1%,再將結(jié)合好蛋白質(zhì)的芯片放入質(zhì)譜儀中檢測(cè)。原始數(shù)據(jù)由工具Proteinchip Software3.2軟件采集,激光強(qiáng)度設(shè)置為185,檢測(cè)靈敏度設(shè)置為7,檢測(cè)上限100,000M／z,優(yōu)化收集數(shù)據(jù)范圍2000-20000M／z。查閱文獻(xiàn)得到的待排除因子在每組篩選差異性峰時(shí)都分別加樣(加入的樣品為重組的以上蛋白質(zhì)),參加對(duì)比,如果差異性峰與某中帶排除因子的峰值相對(duì)應(yīng),說(shuō)明質(zhì)荷比相同,也就說(shuō)明此種差異性蛋白即為無(wú)關(guān)因子,不需要再對(duì)其進(jìn)一步純化和鑒定,將對(duì)比產(chǎn)生的創(chuàng)傷性特殊因子的有意義峰或差異峰進(jìn)行鑒定。 1.3數(shù)據(jù)處理 1)應(yīng)用工具Ciphergen Biosystems軟件3.1版本對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行校正,使得總離子強(qiáng)度與分子量的均一化。 2) Biomarker Wizard和ZUCI蛋白質(zhì)芯片數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)通過(guò)離散小波以去除噪音,并且減掉基線(xiàn)。應(yīng)用局部極值的方法找尋出樣本各自的峰,并且過(guò)濾出信噪比(S／N)大于2之峰。聚類(lèi)分析的最小閾值設(shè)置為10%,歸類(lèi)樣本中質(zhì)荷比(M／z)差異小于0.3%之峰。 3)每個(gè)M／z峰對(duì)樣本區(qū)分的差異顯著性有所不同。初步篩選出的M／z峰做Wilcoxon秩和檢驗(yàn),得出P值來(lái)衡量每峰區(qū)分各個(gè)組別的能力。 4)非線(xiàn)性支持向量機(jī)(SVM)分類(lèi)器對(duì)各個(gè)樣本質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析,篩選出蛋白質(zhì),找尋差異性蛋白質(zhì)。所選用的SVM分類(lèi)器應(yīng)用徑向基核函數(shù),設(shè)置γ參數(shù)為0.6,設(shè)置罰分函數(shù)為19。 1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 將質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)濾噪音,經(jīng)過(guò)聚類(lèi)分析處理,對(duì)各個(gè)組別質(zhì)譜數(shù)據(jù)芒檢驗(yàn)。檢驗(yàn)標(biāo)選α=0.01。確定組間差異蛋白。 1.5血清蛋白質(zhì)分離 通過(guò)固相萃取技術(shù)(SPE)按30%,50%,70%,100%有機(jī)相濃度分裝,做好記錄,根據(jù)親疏水性把蛋白類(lèi)別分開(kāi),后放入真空干燥儀中干燥至10ul,加入Sample Buffer5ul,煮沸15min,離心5000r/min,收集上清液。處理后的樣本經(jīng)過(guò)凝膠電泳分離,根據(jù)距離把分子量不同的蛋白分開(kāi),對(duì)應(yīng)的分子量軸上切膠,分裝至不同EP管中,經(jīng)過(guò)洗滌、脫色、干燥,最后加入胰蛋白酶,酶解出目標(biāo)蛋白。 1.6MALDI-TOF-MS確定差異性蛋白 經(jīng)SPE及電泳分離的各種蛋白質(zhì)與a-Cyano-4-hydroxycinnamic Acid (CHCA)各取1.5ul,兩者混合,置入靶板上,待干。用Cytochrome C(分子量12361.96)+CHCA和Insulin(分子量5734.51)+CHCA校樣。靶板置入MALDI-TOF-MS儀器內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。跟蹤目標(biāo)蛋白峰,確定質(zhì)荷比為5816的蛋白質(zhì)峰的血清樣品。 1.7特異蛋白質(zhì)的鑒定 取經(jīng)酶解后的血清蛋白質(zhì)液填柱上樣；經(jīng)液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜掃描后得到得肽質(zhì)量指紋圖譜,再經(jīng)過(guò)Mascot檢索軟件在Swissprot數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢(xún)比對(duì)。 1.8MALDI-TOF-MS質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理及數(shù)據(jù)庫(kù)檢索 質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理工具軟件為日本島津公司的Launchpad2.4, PMF圖譜檢索采用在線(xiàn)的Mascot檢索工具得以完成。其采用小鼠源以及人源蛋白質(zhì)序列作為數(shù)據(jù)庫(kù),以trypsin酶解,允許的最大漏切位點(diǎn)數(shù)設(shè)置為1；固定修飾是半胱氨酸碘代乙�；�；可變修飾是甲硫氨酸氧化；肽段的質(zhì)量容忍度設(shè)置為±0.3Da(Monoisotopic peak)。 結(jié)果 l.SELDI-TOF-MS檢測(cè)：腎母細(xì)胞瘤血清組和正常小兒組的質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)初步過(guò)濾篩選和統(tǒng)計(jì)分析后得出P值小于0.01的m／z峰15個(gè),從差異顯著蛋白質(zhì)峰的任意組合中,采用SVM篩選出預(yù)測(cè)值的youden指數(shù)(陽(yáng)性率與陰性率之差)最高的組合模型,篩出m／z位于5816的蛋白質(zhì)峰標(biāo)志物,在腎母細(xì)胞瘤組高表達(dá)(強(qiáng)度為2128.3±137.2),正常小兒組明顯低表達(dá)(強(qiáng)度為30.4±7.8),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),經(jīng)交叉檢測(cè),在測(cè)試集上判別該標(biāo)志物組合模型的特異性為100%,敏感度為100%。正常血清組和創(chuàng)傷應(yīng)激血清組比較篩選到差異最顯著的m／z位于5816的蛋白質(zhì)標(biāo)志物,.在創(chuàng)傷組血清中高表達(dá)(強(qiáng)度為3674.6±255.7),正常組中呈明顯低表達(dá)(強(qiáng)度為30.4±7.8),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)；腎母細(xì)胞瘤血清組和創(chuàng)傷應(yīng)激組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。 2.質(zhì)譜分析及數(shù)據(jù)庫(kù)檢索：酶解蛋白質(zhì)樣品后,采用LC-MS/MS測(cè)定該蛋白質(zhì)的酶解肽段,將檢測(cè)得到的PMF經(jīng)過(guò)Mascot檢索程序查詢(xún)蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù),查得對(duì)應(yīng)可能的蛋白質(zhì)為：m／z5816Da,鑒定為硫氧還蛋白(thioredoxin),所檢測(cè)到的肽段氨基酸序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列匹配率為20.00%。 結(jié)論 1、小兒腎母細(xì)胞瘤血清創(chuàng)傷應(yīng)激相關(guān)炎癥因子為硫氧還原蛋白。 2、結(jié)合前期成果,與非創(chuàng)傷性標(biāo)記物載脂蛋白C-I相鑒別,腎母細(xì)胞瘤血清中存在創(chuàng)傷應(yīng)激相關(guān)因子,在一定程度上促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R737.11

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 田美娟;李雨遙;羅長(zhǎng)琴;呂美玲;楊謹(jǐn);;腎透明細(xì)胞癌中氧化應(yīng)激蛋白的表達(dá)[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2012年08期

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本文編號(hào)：1183061