本文關(guān)鍵詞：牛乳鐵蛋白對大鼠小腸空腸上皮細胞株的影響研究

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【摘要】：研究背景新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎(neonatal necrotizing enterocolitis,NEC)是早產(chǎn)兒死亡的主要原因之一,是新生兒常見的消化道急癥之一,主要發(fā)生在早產(chǎn)兒,且胎齡越小,出生體重越低,發(fā)生率越高。腸壁囊樣積氣和門靜脈充氣征為X線特征,發(fā)病因素具有多源性,故其發(fā)病機制至今尚不明確,大多認為與早產(chǎn)、喂養(yǎng)不當、感染、腸道黏膜缺氧缺血及細菌異常種植等原因有關(guān),預防上也沒有明確的指南。NEC患者輕者可能出現(xiàn)嘔吐、腹脹,重者則可能出現(xiàn)嗜睡、體溫不穩(wěn)、休克或出現(xiàn)腹壁紅腫、腹腔積液,短期內(nèi)可引起多種嚴重的并發(fā)癥(如腸狹窄、腹膜炎等),會出現(xiàn)小頭畸形或嚴匝神經(jīng)發(fā)育問題,且重癥NEC有較高的致殘率[3-4]。我國出生體質(zhì)量1.5kg的嬰兒NEC發(fā)病率6%～10%,國內(nèi)病死率為10%～50%；美國出生體質(zhì)量1.5 kg嬰兒的發(fā)病率為5%～15%,病死率20%～30%。目前,臨床上主要根據(jù)臨床表現(xiàn)以及最常用的輔助檢查方法腹部X線片作為早期診斷NEC的方法,但此后者雖對于診斷NEC特異度較高,但對于疾病的早期診斷卻沒有太大意義。臨床中也可以通過B超發(fā)現(xiàn)門靜脈的起泡幫助NEC的早期這段,而且臨床中還有很多關(guān)于IL-8、IL-1以及IL-10受體拮抗劑或脂肪酸結(jié)合蛋白等生化指標用于輔助診斷NEC的研究,但仍缺乏較好的用于早期診斷NEC的血生化指標。新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎其重要的病理生理過程復雜,理論上任何影響腸道血流的因素都會增加NEC的發(fā)生,加之新生兒或早產(chǎn)兒胃腸道功能的不完善,加之外界環(huán)境的改變感染,導致腸腔內(nèi)細菌以及內(nèi)毒素等由上皮細胞間隙進入人體造成局部組織或全身炎癥反應(yīng)。腸上皮細胞作為直接接觸外界腸道微環(huán)境的細胞,對維持腸道功能具有不可替代的作用。腸道上皮細胞是維持腸道上皮通透性的執(zhí)行者,起著至關(guān)重要的作用,一方面其可以作為機械屏障非選擇性發(fā)揮抵御外來生物體及有毒物質(zhì)進入人體的作用,另外一方面其可以特異性選擇準許小分子物質(zhì)、離子進入通過腸道上皮屏障,而將抗原大分子、外界的病原微生物等阻礙在屏障之外。許多研究都顯示NEC的發(fā)病機制中腸道上皮細胞起著重要的作用。腸道作為人體重要的免疫器官,人體有80%的免疫細胞存在于腸道中,當NEC發(fā)生時,NEC會產(chǎn)生大量的炎癥因子以及相關(guān)細胞因子,從而加重了腸道粘膜的損傷,同時也會造成其他重要器官,如腦的損傷。因此有許多研究都嘗試通過口服抗生素來減少致病因素的發(fā)生,但口服抗生素同時會影響腸道正常菌群的建立,尤其是對于新生兒來說,正常腸道菌群對于維持機體穩(wěn)態(tài)相比較于己經(jīng)有一定免疫能力的成年人來說更是重要得多,因此目前已很少采用服用口服抗生素來預防NEC的發(fā)生。與此同時,近些年益生菌預防NEC的研究也很火熱。直至Mori等人通過回顧性的研究分析了日本大阪1982至2006年NICU的NEC發(fā)生率與臨床治療策略的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)母乳喂養(yǎng)、使用益生菌和避免臍靜脈置管是降低NEC發(fā)生的主要原因。乳鐵蛋白作為母乳中重要的蛋白成分,已被證實具有光譜的抗炎、抗氧化等對新生兒保護的作用,但由于人乳鐵蛋白具有原料昂貴的特點,商品話存在一定的限制。牛乳鐵蛋白具有與人乳鐵蛋白70%以上的同源序列,且我國可利用牛乳加工奶酪時的副產(chǎn)物乳清進行加工提取牛乳鐵蛋白,所以相對于從人乳中提取乳鐵蛋白,利用牛乳生產(chǎn)商業(yè)化的牛乳鐵蛋白原料極為豐富。綜上所述,本研究擬從臨床新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎病理生理過程為切入點,利用腸道上皮細胞模擬體外細胞炎癥模型,以此評價牛乳鐵蛋白對腸上皮細胞的影響,尤其是在炎癥模型下抗炎的作用,為天然藥物研發(fā)及臨床應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)。目的1.探究牛乳鐵蛋白對IEC-6細胞細胞活性的影響：2.研究牛乳鐵蛋白對IEC-6細胞增殖能力的影響及機制；3.探討牛乳鐵蛋白在LPS體外誘導的IEC-6細胞炎癥模型下對細胞炎癥的影響及機制。方法1.細胞活性的檢測MTT法檢測bLF對IEC-6細胞線粒體活性的影響,MTT全稱為3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,,是一種黃顏色的染料,活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲瓚(Formazan)并沉積在細胞中,而死細胞無此功能。二甲基亞砜(DMSO),俗稱萬能溶劑,能溶解細胞中的甲瓚,用酶聯(lián)免疫檢測儀特定波長處測定其光吸收值,可間接反映活細胞數(shù)量。在一定細胞數(shù)范圍內(nèi),MTT結(jié)晶形成的量與細胞數(shù)目或細胞內(nèi)線粒體的活性成正比。本實驗通過比較牛乳鐵蛋白處理與非處理組其吸光吸收值來比較細胞活性的變化。2.細胞增殖能力的檢測Brdu,即5-Bromo-2'-Deoxyuridine,全名5-溴脫氧尿嘧啶核苷,為細胞有絲分裂所必須需胸腺嘧啶的衍生物,可代替胸腺嘧啶在DNA合成期(S期),用BrdU預處理的細胞中,BrdU可代替胸腺嘧啶核苷插入復制的DNA雙鏈中,而且這種置換可以穩(wěn)定存在,并帶到子代細胞中。細胞經(jīng)過固定和變性處理后,可用免疫學方法檢測DNA中BrdU的含量(如采用鼠抗BrdU單克隆抗體特異識別BrdU,再采用辣根過氧化酶標記的山羊抗鼠IgG二抗標記,最后用比色法或熒光的方法進行定量測定),從而判斷細胞的增殖能力。3.流式細胞術(shù)細胞周期的檢測細胞在增殖過程中,首先會發(fā)生DNA的復制,通過將熒光標記的碘化丙啶PI插入到DNA雙鏈中,可以通過插入量來評價細胞內(nèi)DNA含量,后通過流式細胞術(shù)來檢測每個細胞中標記的熒光來評估細胞所處的細胞分裂時間段。4.實時熒光定量PCR細胞因子轉(zhuǎn)錄水平的檢測實時熒光定量PCR技術(shù)就是指在普通PCR的反應(yīng)體系中加入熒光基團,從而利用熒光信號累計來檢測整個PCR過程,最后通過擴增曲線來檢測特異靶基因的mRNA表達水平。在本實驗中通過比較在LPS刺激下,相關(guān)細胞因子(IL-6、IL-8、TNF-α、IL-1β)在IEC-6細胞中mRNA水平,從而評價bLF對抗炎癥的效應(yīng)。5. ELISA細胞培養(yǎng)上清中細胞因子的檢測ELISA,即酶聯(lián)免疫吸附試驗,其原始是使抗原或抗體結(jié)合到96孔板固相載體表面,并在有效期內(nèi)保持其免疫活性,后用使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體,這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性,又保留酶的活性。在測定時,把受檢標本(本實驗中為細胞培養(yǎng)上清)和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質(zhì)分開,最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后,底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物,產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān),故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺刊物定性或定量分析。由于酶的催化效率很高,故可極大地放大反應(yīng)效果,從而使測定方法達到很高的敏感度。通過用bLF(預)處理IEC-6細胞,或同時用LPS刺激IEC-6細胞,用商業(yè)化的ELISA試劑盒檢測細胞培養(yǎng)上清中的IL-8、IL-6以及TNF-α的含量。6. Western blot檢測信號通路激活及抑制情況MAKP,即絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)是一種能被不同的細胞刺激因子刺激,如細胞因子、氧化應(yīng)激、激素、炎癥等激活的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶。所有真核細胞都能表達MAPK,其與MKKK、MKK、共同調(diào)節(jié)細胞的生長、對環(huán)境應(yīng)激的適應(yīng)以及炎癥反饋等過程。NF-κB,是細胞自身防御、損傷應(yīng)激、細胞分化和凋亡過程中重要的信息傳遞者。作為MAPK重要的下游分子,NF-κB是細胞多種損傷反應(yīng)基因的調(diào)節(jié)因子,有大量的研究已經(jīng)報道在靜息狀態(tài)下,NF-κB常與其抑制性蛋白I-κB蛋白結(jié)合并穩(wěn)定存在于細胞胞漿中,p38被激活后可磷酸化I-κ B,進而I-κ B被降解,從而與NF-κB解聚,解聚后的NF-κB發(fā)生核轉(zhuǎn)位,繼而與DNA接觸,啟動或抑制有關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。通過比較bLF(預)處理IEC-6細胞后,LPS誘導的MAPK信號通路激活情況探究bLF抗炎的分子機制。7.統(tǒng)計學方法統(tǒng)計學比較用GraphPad Prism 5.01軟件進行單因素方差分析(One-way ANOVA),后多重比較組間差異用Newman Keuls方法,當P0.05被認為有統(tǒng)計學意義。結(jié)果1.bLF可顯著提高IEC-6細胞的細胞活性；2.bLF通過調(diào)節(jié)細胞周期S期來促進IEC-6細胞增殖；3.bLF通過抑制LPS誘導的MAPK磷酸化激活,從而抑制NF-κB核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)IEC-6炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-8的表達。結(jié)論牛乳乳鐵蛋白可促進大鼠小腸上皮隱窩細胞株IEC-6的細胞活性及增殖能力,在LPS誘導的炎癥反應(yīng)中,牛乳鐵蛋白可通過抑制MAPK磷酸化抑制NF-κB激活及核轉(zhuǎn)位,從而抑制IEC-6相關(guān)細胞炎癥因子的細胞內(nèi)mRNA表達和細胞外分泌起到抗炎癥效應(yīng),牛乳鐵蛋白可能在未來治療新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎中發(fā)揮重要作用。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R722.1

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1 李煥春,肖國強;運動功能與乳鐵蛋白特性的關(guān)系[J];中國臨床康復;2004年24期

2 盧蓉蓉;孫震;許時嬰;;乳鐵蛋白體外和體內(nèi)鐵結(jié)合能力的研究[J];食品科學;2006年05期

3 ;國際第9屆及中國第1屆乳鐵蛋白會議通知[J];中國藥理學與毒理學雜志;2009年02期

4 簡紅霞;劉梯樓;;火焰原子吸收分光光度法測定牛乳鐵蛋白中的痕量鐵[J];微量元素與健康研究;2011年01期

5 ;乳清乳鐵蛋白臨床應(yīng)用征文通知[J];臨床兒科雜志;2012年08期

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8 ;乳清乳鐵蛋白臨床應(yīng)用征文通知[J];臨床兒科雜志;2013年03期

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10 衛(wèi)霖;韓明子;;乳鐵蛋白在消化疾病中的應(yīng)用價值[J];胃腸病學和肝病學雜志;2013年02期

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1 王艷萍;;天然多功能性原料乳鐵蛋白無菌液關(guān)鍵技術(shù)的開發(fā)[A];第三屆中國奶業(yè)大會論文集(下冊)[C];2012年

2 譚炳海;梁靖坤;張桂林;曹榮峰;;牛乳鐵蛋白提純方法的建立與電泳分析[A];中國畜牧獸醫(yī)學會家畜內(nèi)科學分會2009年學術(shù)研討會論文集[C];2009年

3 高會樂;范麗;龐志清;蔣新國;;轉(zhuǎn)鐵蛋白和乳鐵蛋白連接聚合物泡囊腦靶向性評價[A];2009年中國藥學大會暨第九屆中國藥師周論文集[C];2009年

4 俞媛;尹琪;蔣新國;;自組裝乳鐵蛋白-聚合物泡囊載香豆素-6的體外腦遞藥特性研究[A];2009年中國藥學大會暨第九屆中國藥師周論文集[C];2009年

5 曲練達;王術(shù)德;侯喜林;樸范澤;;乳鐵蛋白的分離純化[A];中國畜牧獸醫(yī)學會家畜傳染病學分會第六屆理事會第二次會議暨教學專業(yè)委員會第六屆代表大會論文集[C];2006年

6 曲練達;王術(shù)德;侯喜林;樸范澤;;乳鐵蛋白的分離純化以及免疫作用的研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學會家畜傳染病學分會第六屆理事會第二次會議暨教學專業(yè)委員會第六屆代表大會論文集[C];2006年

7 謝永剛;汪以真;韓菲菲;劉倚帆;;乳鐵蛋白N葉在嗜甲醇畢赤酵母中的表達及其活性分析[A];中國畜牧獸醫(yī)學會動物營養(yǎng)學分會第十次學術(shù)研討會論文集[C];2008年

8 張曉春;葛良鵬;李誠;;乳鐵蛋白、抗壞血酸和乳酸鈉復合保鮮冷鮮調(diào)理肉初探[A];第五屆中國畜牧科技論壇論文集[C];2011年

9 許寧;陳群;;牛乳鐵蛋白質(zhì)量標準的研究[A];第二屆浙江中西部科技論壇論文集第七卷（藥學分卷Ⅱ）[C];2005年

10 劉倚帆;汪以真;韓菲菲;謝永剛;;乳鐵蛋白肽及其衍生物體外抑菌效果比較[A];中國畜牧獸醫(yī)學會動物營養(yǎng)學分會第十次學術(shù)研討會論文集[C];2008年

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1 李詩;乳鐵蛋白——一種全新的營養(yǎng)素[N];中國食品安全報;2011年

2 蔡輝;乳鐵蛋白——一種全新的營養(yǎng)素[N];中國醫(yī)藥報;2001年

3 記者 王軍;新百利——帕拉丁引進乳鐵蛋白生產(chǎn)技術(shù)[N];中國食品質(zhì)量報;2009年

4 記者王亞南 張嶷;堿性蛋白及乳鐵蛋白將成功能性配料新寵[N];中國食品報;2010年

5 林偉;日本培育出營養(yǎng)番茄[N];山西科技報;2001年

6 本報記者 王薇;伊利營養(yǎng)舒化奶乳鐵蛋白新品以創(chuàng)新贏未來[N];中國食品報;2012年

7 記者 王城;中比合作研發(fā)乳生物活性物質(zhì)[N];中國食品報;2009年

8 新華;日研究發(fā)現(xiàn)乳鐵蛋白對丙肝有效[N];中國醫(yī)藥報;2001年

9 中國醫(yī)科院藥用植物研究所研究員 郭伽;母乳新解[N];健康報;2008年

10 記者 黃建明;牛奶中乳鐵蛋白能治骨折[N];新華每日電訊;2004年

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1 杜巧燕;集成化擴張床技術(shù)從甜乳清中分離乳鐵蛋白和免疫球蛋白G[D];浙江大學;2013年

2 劉瑋琳;脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)和消化穩(wěn)定性及其形成機理[D];南昌大學;2013年

3 白雪晶;牛乳鐵蛋白衍生抗菌片段分子設(shè)計與構(gòu)效關(guān)系[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2010年

4 夏明;水解進程對乳蛋白酶解產(chǎn)物抗菌性能的影響研究[D];浙江大學;2011年

5 郎建社;乳鐵蛋白抑制SARS冠狀病毒感染宿主細胞的機理研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2010年

6 伍喜林;乳鐵蛋白對隔離早期斷奶仔豬營養(yǎng)生理效應(yīng)的研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學;2004年

7 王軍;乳鐵蛋白在CCI大鼠的鎮(zhèn)痛作用與NO-cGMP-PKG信號通路的激活[D];中國醫(yī)科大學;2009年

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1 張曉春;乳鐵蛋白的提取及其在預調(diào)理肉保鮮中的應(yīng)用研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學;2008年

2 倪丹;乳鐵蛋白特性評價與研究[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學;2011年

3 張英華;乳鐵蛋白的提取、促進鐵吸收及其抑菌性質(zhì)的研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學;2000年

4 邸維;熱處理對乳鐵蛋白理化特性及促成骨細胞增殖活性的影響[D];煙臺大學;2012年

5 孔瑩瑩;乳鐵蛋白的成骨作用機制及熱處理對其活性影響研究[D];哈爾濱工業(yè)大學;2012年

6 巫曉強;乳鐵蛋白對去卵巢大鼠IGF-IR、IGFBP-2、IGFBP-4mRNA表達影響的研究[D];福建醫(yī)科大學;2015年

7 王韞;乳鐵蛋白分子組成對其促成骨細胞增殖的影響研究[D];哈爾濱工業(yè)大學;2015年

8 李暢;乳鐵蛋白水解物中抗菌肽的分離與純化[D];東北農(nóng)業(yè)大學;2015年

9 曹，

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