本文關(guān)鍵詞：LMNA相關(guān)肌營(yíng)養(yǎng)不良患兒的表型-基因型分析及LMNA突變體功能研究

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【摘要】：目的：分析兒童早期起病的LMNA相關(guān)肌營(yíng)養(yǎng)不良（LMNA related musculardystrophy）患兒的病例資料，了解中國(guó)患者的臨床表現(xiàn)、肌肉病理改變特點(diǎn)，進(jìn)一步行基因檢測(cè)分析遺傳學(xué)特點(diǎn)，探討表型與基因型的關(guān)聯(lián)性，并進(jìn)行部分LMNA突變體功能研究，初步探討其可能的致病機(jī)制。 方法：參考文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)符合LMNA相關(guān)肌營(yíng)養(yǎng)不良診斷標(biāo)準(zhǔn)的病例進(jìn)行臨床診斷并納入研究，共收集17例。對(duì)先證者進(jìn)行肌活檢者行常規(guī)組織學(xué)染色，并電鏡觀察肌纖維超微結(jié)構(gòu)的改變。提取先證者及其父母外周血基因組DNA，PCR擴(kuò)增LMNA的12個(gè)外顯子，以瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物純化后DNA直接測(cè)序，確定基因突變的類(lèi)型。部分患者同時(shí)提取外周血總RNA，行逆轉(zhuǎn)錄PCR（Reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）逆轉(zhuǎn)錄為cDNA作為PCR的模板，并從剪切突變的兩端設(shè)計(jì)引物觀察剪切突變?cè)赗NA水平造成的改變。通過(guò)特異抗體進(jìn)行培養(yǎng)的皮膚成纖維細(xì)胞免疫熒光染色及構(gòu)建4種真核表達(dá)突變體進(jìn)行核纖層蛋白A/C的體外表達(dá)及亞細(xì)胞定位等功能研究。 結(jié)果： 1、臨床表型特點(diǎn)：17例均符合LMNA相關(guān)肌營(yíng)養(yǎng)不良的臨床診斷，，其中11例診斷為L(zhǎng)MNA-相關(guān)的先天性肌營(yíng)養(yǎng)不良（LMNA-related congenital musculardystrophy，L-CMD）、6例常染色體顯性遺傳的Emery-Dreifuss肌營(yíng)養(yǎng)不良（Emery-Dreifuss muscular dystrophy，EDMD）。診斷為L(zhǎng)-CMD的病例主要表現(xiàn)為新生兒至嬰幼兒期起病的迅速進(jìn)展的軀干及頸軸肌無(wú)力，豎頭無(wú)力，由遠(yuǎn)端至近端進(jìn)展的關(guān)節(jié)攣縮，脊柱畸形，肌張力減低、腱反射減弱或消失；診斷為EDMD的病例主要表現(xiàn)為1-5歲發(fā)病的緩慢進(jìn)展的肩胛腓骨肌無(wú)力及肌萎縮，由近端至遠(yuǎn)端進(jìn)展的關(guān)節(jié)攣縮，脊柱畸形，肌張力減低、腱反射減弱或消失。兩者血清肌酸激酶（creatine kinase， CK）均輕至中度升高，肌電圖(electromyogram，EMG)呈肌源性損害，心電圖可提示心律失常，頭顱磁共振成像（Magnetic Resonance Imaging，MRI）正常。 2、肌肉病理特點(diǎn)：17例患兒中12例行腓腸肌活檢，進(jìn)行常規(guī)組織學(xué)染色及酶組織化學(xué)染色，通過(guò)電鏡觀察肌纖維超微結(jié)構(gòu)。蘇木精-伊紅（Hema-toxylinand Eosin，HE）染色等提示為肌營(yíng)養(yǎng)不良改變或肌肉病樣改變，起病早的L-CMD可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。電鏡下顯示局灶或大片肌絲破壞、肌節(jié)模糊、肌纖維內(nèi)大量空泡，大量脂肪結(jié)締組織結(jié)構(gòu)，肌細(xì)胞核形態(tài)異常、異染色質(zhì)濃縮，核膜局灶缺失，可見(jiàn)核帶、核仁裂，核周線粒集聚。 3、基因型：17例患兒均行致病基因LMNA突變篩查并基因確診，所有突變均為雜合突變，包括13例錯(cuò)義突變、3例缺失突變及1例剪切突變。本研究共發(fā)現(xiàn)16種致病突變，其中8種為未報(bào)道的突變。14例已完成突變來(lái)源驗(yàn)證，其中1例突變來(lái)自父親、13例為新生突變。c.91GA、c.94_96delAAG、c.116AG、c.745CT、c.746GA、c.832GC、c.1124CG、c.1580GC等突變與LMNA相關(guān)肌營(yíng)養(yǎng)不良關(guān)系密切。 4、LMNA突變對(duì)核纖層蛋白A/C功能的影響：對(duì)1例進(jìn)行皮膚成纖維細(xì)胞免疫熒光染色，結(jié)果顯示細(xì)胞核大小和形態(tài)異常，核纖層蛋白A/C蛋白在細(xì)胞核內(nèi)有表達(dá)，但分布不均勻。野生型及突變體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，熒光顯微鏡下顯示突變體的核纖層蛋白A/C在細(xì)胞核內(nèi)分布異常。 結(jié)論： 1、17例LMNA相關(guān)肌營(yíng)養(yǎng)不良患兒的臨床癥狀符合EDMD或L-CMD臨床表現(xiàn)，肌肉病理提示肌營(yíng)養(yǎng)不良改變或肌肉病樣改變，起病早的L-CMD可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。電鏡下可見(jiàn)大量肌纖維結(jié)構(gòu)破壞，肌細(xì)胞核形態(tài)異常。 2、本研究發(fā)現(xiàn)的突變均為雜合突變，大部分為新生突變，符合該組疾病基因突變特點(diǎn)，共發(fā)現(xiàn)了8種新突變。其中c.91GA、c.94_96delAAG、c.116AG、c.745CT、c.746GA、c.832GC、c.1124CG、c.1580GC等突變與LMNA相關(guān)肌營(yíng)養(yǎng)不良密切關(guān)聯(lián)。 3、LMNA突變導(dǎo)致核纖層蛋白A/C在細(xì)胞核內(nèi)分布異常，從而使細(xì)胞核形態(tài)及大小改變，可能是LMNA相關(guān)肌營(yíng)養(yǎng)不良的發(fā)病機(jī)制之一。
【關(guān)鍵詞】：LMNA相關(guān)肌營(yíng)養(yǎng)不良 突變 核纖層蛋白A/C 功能研究
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R746.2
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 中英文對(duì)照表10-11
• 第1章 引言11-13
• 第2章 材料與方法13-27
• 2.1 研究對(duì)象13-14
• 2.1.1 入選及分組標(biāo)準(zhǔn)13
• 2.1.2 倫理審批13-14
• 2.1.3 臨床資料收集14
• 2.2 主要材料和試劑14-15
• 2.2.1 肌肉組織化學(xué)染色14
• 2.2.2 基因診斷與分析14
• 2.2.3 皮膚成纖維細(xì)胞、HEK293 細(xì)胞培養(yǎng)14
• 2.2.4 RT-PCR14-15
• 2.2.5 定點(diǎn)突變及質(zhì)粒構(gòu)建、提取15
• 2.2.6 免疫熒光及細(xì)胞轉(zhuǎn)染15
• 2.3 主要儀器與耗材15-16
• 2.4 主要液體配制16-18
• 2.4.1 肌肉組織化學(xué)染色16-17
• 2.4.2 基因診斷與分析17
• 2.4.3 細(xì)胞培養(yǎng)17-18
• 2.4.4 免疫熒光18
• 2.5 主要應(yīng)用軟件18
• 2.6 主要實(shí)驗(yàn)方法18-27
• 2.6.1 肌肉組織化學(xué)染色18-19
• 2.6.2 提取外周血白細(xì)胞 DNA（鹽析法）19
• 2.6.3 提取外周血淋巴細(xì)胞 RNA（TRIzol 法）、反轉(zhuǎn)錄為 cDNA 單鏈19-20
• 2.6.4 基因突變篩查20-22
• 2.6.5 細(xì)胞培養(yǎng)22-23
• 2.6.6 野生型與突變體質(zhì)粒構(gòu)建23-24
• 2.6.7 質(zhì)粒大提24-25
• 2.6.8 免疫熒光及細(xì)胞轉(zhuǎn)染25-27
• 第3章 結(jié)果27-37
• 3.1 臨床表現(xiàn)特點(diǎn)及輔助檢查27-30
• 3.1.1 臨床表現(xiàn)特點(diǎn)27
• 3.1.2 輔助檢查特點(diǎn)27-30
• 3.2 基因檢測(cè)結(jié)果30-32
• 3.3 LMNA 野生型及突變體構(gòu)建32-35
• 3.4 免疫熒光染色及細(xì)胞轉(zhuǎn)染35-37
• 第4章 討論37-45
• 4.1 LMNA 相關(guān)肌營(yíng)養(yǎng)不良臨床特點(diǎn)37-38
• 4.2 LMNA 相關(guān)肌營(yíng)養(yǎng)不良基因型與表型相關(guān)性38-42
• 4.3 LMNA 相關(guān)肌營(yíng)養(yǎng)不良發(fā)病機(jī)制研究42-45
• 第5章 結(jié)論45-46
• 致謝46-47
• 參考文獻(xiàn)47-50
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果50-51
• 綜述51-57
• 參考文獻(xiàn)55-57

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 陳銀紅;王曉靜;沈宏銳;胡靜;;杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良和遺傳咨詢(xún)[J];臨床薈萃;2013年05期

本文編號(hào)：1042920