本文關(guān)鍵詞：尾加壓素Ⅱ?qū)Ψ蝿?dòng)脈平滑肌細(xì)胞膠原合成的影響及其細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究

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【摘要】：研究背景及目的 肺動(dòng)脈高壓是各種原因引起的靜息狀態(tài)下右心導(dǎo)管測(cè)得的肺動(dòng)脈平均壓(mean pulmonary arterial pressure mPAP)≥25mmHg的一組臨床病理生理綜合癥。先天性心臟病是小兒最常見(jiàn)的心臟病,在1000個(gè)出生存活嬰兒中,發(fā)生本病者約6-8名,中國(guó)每年大約有15萬(wàn)新生嬰兒患有各種類型的先天性心臟病(congenital heart disease, CHD),而肺動(dòng)脈高壓是CHD常見(jiàn)且嚴(yán)重的并發(fā)癥。房間隔缺損(atrial septal defect, ASD).室間隔缺損(ventricular septal defect, VSD)及動(dòng)脈導(dǎo)管未閉(patent ductus arteriosus, PDA)是兒童常見(jiàn)左向右分流型CHD,隨著病情進(jìn)展,肺循環(huán)血流量持續(xù)增加,逐漸形成肺動(dòng)脈高壓,發(fā)展成為艾森曼格(Eisenmenger)綜合癥,伴有肺動(dòng)脈高壓的CHD患者手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)性及死亡率明顯增加,甚至失去手術(shù)機(jī)會(huì)。目前對(duì)肺動(dòng)脈高壓尚無(wú)有效的治療方法。肺動(dòng)脈高壓的特征性病理改變?yōu)榉窝苁湛s反應(yīng)增強(qiáng)及肺血管結(jié)構(gòu)重建。肺血管收縮反應(yīng)增強(qiáng)屬功能性改變,是可逆的；肺血管結(jié)構(gòu)重建是肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞肥大、增殖及膠原等細(xì)胞外間質(zhì)沉積引起肺血管管壁增厚,管腔狹窄,屬結(jié)構(gòu)性改變,是不可逆的。 近二十多年來(lái),UⅡrotensinⅡ,UⅡ)從1985年自硬骨魚(yú)尾垂腺中分離出到如今作為人類心血管疾病病理生理過(guò)程中的一種重要調(diào)節(jié)因子而被廣泛關(guān)注研究證實(shí)體內(nèi)一種孤立的G蛋白藕聯(lián)受體—GPR14是UⅡ的特異性受體(UT),UⅡ及其受體廣泛分布于人體的心血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、腎臟、胰腺等多種組織。UⅡ與UT結(jié)合,能夠引起一系列生物學(xué)效應(yīng),包括血管收縮,促血管平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及癌細(xì)胞的增殖及細(xì)胞的遷移等。UⅡ在肺動(dòng)脈高壓形成過(guò)程中起重要作用,且目前己發(fā)現(xiàn)UT受體特異性抑制劑Urantide,可以拮抗UⅡ的上述作用。但UⅡ及其受體拮抗劑Urantide對(duì)培養(yǎng)的Wistar大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖及其對(duì)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞I、Ⅲ型膠原合成的影響尚未見(jiàn)報(bào)道,UⅡ及其受體拮抗劑Urantide調(diào)節(jié)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞膠原合成的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。 本研究的目的是研究尾加壓素Ⅱ(Urotensi n Ⅱ,U Ⅱ)及其受體拮抗劑Uranti de對(duì)培養(yǎng)的大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(PASMCs)增殖及I、Ⅲ型膠原(collagen Ⅰ.Ⅲ)合成的影響,探討細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶途徑(extracellular signal-regulated kinase1/2,ERK1/2)是否參與了促肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖及膠原合成增加過(guò)程。為Urantide通過(guò)阻止UⅡ的促增殖作用來(lái)實(shí)現(xiàn)其延緩肺動(dòng)脈高壓發(fā)生發(fā)展的說(shuō)法提供理論依據(jù)。 方法 1.動(dòng)物選擇：取120g左右健康雄性Wistar大鼠,行肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞分離并進(jìn)行原代培養(yǎng),經(jīng)Rabbit anti-α-actin單克隆抗體及FITC免疫熒光進(jìn)行細(xì)胞鑒定。 2.肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞原代培養(yǎng)：以組織貼塊法培養(yǎng)的大鼠PASMCs為研究對(duì)象,分為不同實(shí)驗(yàn)組：①UⅡ作用組：將不同濃度(10-10mol/L～10-7mol/L)UⅡ加入細(xì)胞培養(yǎng)孔,(每個(gè)濃度n=5),觀察UⅡ?qū)ASMCs增殖的影響；②Urantide阻斷組：10-7mol/L Urantide作用30min后加入10-7mol/L UⅡ繼續(xù)作用24h(n=5),觀察Urantide對(duì)UⅡ的拮抗作用；③PD98059抑制組：10-5mol/L PD98059作用30min后加入10-7mol/LUⅡ繼續(xù)作用2h(n=5),觀察PD98059對(duì)磷酸化ERK1/2的抑制作用；④對(duì)照組：未加入U(xiǎn)Ⅱ及其受體拮抗劑(n=5)。 3.培養(yǎng)PASMCs增殖：采用CCK-8法及BrdU摻入實(shí)驗(yàn)測(cè)定UⅡ及Urantide對(duì)培養(yǎng)大鼠PASMCs增殖的影響。 4.實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)UⅡ及Urantide對(duì)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞I、Ⅲ型膠原及p-ERK1/2基因表達(dá)的影響,同時(shí)測(cè)定PD98059對(duì)p-ERK1/2基因表達(dá)的影響。 5.Western blotting測(cè)定UⅡ及Urantide對(duì)培養(yǎng)大鼠PASMCs Ⅰ、Ⅲ膠原及磷酸化ERKl/2蛋白表達(dá)的影響,同時(shí)檢測(cè)PD98059對(duì)磷酸化ERK1/2蛋白表達(dá)的影響。 結(jié)果 1.本研究通過(guò)組織貼塊法成功原代培養(yǎng)出肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞,經(jīng)Rabbit anti-α-actin單克隆抗體及FITC免疫熒光對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定,其純度達(dá)95%。 2.CCK-8細(xì)胞生長(zhǎng)測(cè)定及BrdU摻入實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：不同濃度的UⅡ(10-9mol/L～10-7mol/L)可濃度依賴性地促進(jìn)PASMCs的增殖(P0.05,P0.001),其中UⅡ(10-7mol/L),促增殖作用最明顯(P0.001)；UⅡ(10-10mol/L)無(wú)明顯促細(xì)胞增殖作用(P0.05).Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：UⅡ濃度依賴性地增加PASMCs Ⅰ、Ⅲ型膠原基因表達(dá)；Western blotting結(jié)果顯示：UⅡ可濃度依賴性地增加PASMCs Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)(P0.05,P0.001)。其中UⅡ(10-7mol/L),促膠原合成作用最明顯(P0.001),UⅡ(10-100mol/L)無(wú)明顯促膠原合成作用(P0.05)。 3.Real-time PCR及Western blotting分別從基因及蛋白水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：UⅡ可誘導(dǎo)ERKl/2磷酸化,細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶抑制劑PD98059可顯著抑制磷酸化ERK1/2基因及蛋白表達(dá)(P0.05,P0.001)。 4.UⅡ受體拮抗劑Urantide可抑制UⅡ的促肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖,促I(mǎi)Ⅲ兀型膠原合成作用及誘導(dǎo)ERK1/2磷酸化作用。(P0.01,P0.05)。 結(jié)論 1.本研究成功分離并培養(yǎng)了大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞,培養(yǎng)細(xì)胞純度達(dá)95%是良好的實(shí)驗(yàn)材料,提高了實(shí)驗(yàn)的可行性及準(zhǔn)確性。 2.UⅡ濃度依賴性地促進(jìn)PASMCs增殖,增加PASMCs Ⅰ、Ⅲ膠原的基因及蛋白水平的表達(dá)。 3.UⅡ上調(diào)ERK1/2磷酸化水平,ERK1/2拮抗劑PD98059可抑制UⅡ的促進(jìn)作用。說(shuō)明細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶信號(hào)通路參與了PASMCs增殖及膠原合成過(guò)程。 4.UⅡ受體拮抗劑Urantide可拮抗UⅡ的促增殖、促膠原合成及誘導(dǎo)ERK1/2磷酸化作用。說(shuō)明UⅡ與其受體結(jié)合后,通過(guò)誘導(dǎo)ERK1/2磷酸化激活ERKl/2途徑,進(jìn)而誘導(dǎo)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖及I、Ⅲ膠原合成增加。
【關(guān)鍵詞】：尾加壓素Ⅱ 肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞 膠原合成 細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶 肺動(dòng)脈高壓 大鼠 Wistar
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R725.4
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• ABSTRACT9-12
• 縮寫(xiě)說(shuō)明12-13
• 前言13-15
• 實(shí)驗(yàn)方法15-27
• 結(jié)果27-29
• 討論29-35
• 結(jié)論35-36
• 附圖表36-45
• 參考文獻(xiàn)45-48
• 綜述48-54
• 參考文獻(xiàn)52-54
• 致謝54-55
• 攻讀碩士學(xué)位論文期間發(fā)表的論文55-56
• 學(xué)位論文評(píng)閱及答辯情況表56

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前6條

1 張正浩,張孫曦,李菊香,何其華,牛大地,王述Y，

本文編號(hào)：1028417