發(fā)布時(shí)間：2017-10-07 00:27

  本文關(guān)鍵詞：表達(dá)Flt3L的重組狂犬病病毒的構(gòu)建及其免疫原性的研究

  更多相關(guān)文章： 狂犬病 疫苗 Flt3L 中和抗體 樹(shù)突狀細(xì)胞

【摘要】：狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)引起的以中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染為特征的人畜共患傳染病,人和動(dòng)物一旦發(fā)病死亡率幾乎達(dá)100%(WHO 2009)。全世界每年因狂犬病死亡的人數(shù)超過(guò)55000人,我國(guó)是狂犬病高發(fā)國(guó)家之一。目前狂犬病尚無(wú)特效的治療方法或藥物,疫苗的預(yù)防接種是該病防控的重要手段。本研究通過(guò)反向遺傳操作技術(shù)在狂犬病病毒疫苗株LBNSE基因組中插入鼠源FMS樣酪氨酸激酶3配體(Fms-like tyrosine kinase 3 ligand,Flt3L)基因,構(gòu)建了重組狂犬病病毒LBNSE-Flt3L。ELISA檢測(cè)結(jié)果表明重組狂犬病病毒LBNSE-Flt3L可在感染的BSR細(xì)胞表達(dá)Flt3L且具有劑量依賴性。LBNSE-Flt3L在體外生長(zhǎng)曲線與親本毒株幾乎一致,表明外源基因Flt3L的表達(dá)對(duì)病毒的復(fù)制與擴(kuò)散沒(méi)有影響。腦部攻毒實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小鼠并無(wú)發(fā)病癥狀,其體重呈先下降后上升的趨勢(shì),較親本毒株LBNSE對(duì)小鼠致病性減弱,但差異不顯著。為進(jìn)一步研究LBNSE-Flt3L的免疫原性,將重組狂犬病病毒免疫小鼠,與親本病毒LBNSE進(jìn)行比較,并將實(shí)驗(yàn)室之前構(gòu)建的LBNSE-GM-CSF(Wen et al 2011)作為陽(yáng)性對(duì)照。在免疫后第1-10周每周采血檢測(cè)其體內(nèi)的中和抗體水平,發(fā)現(xiàn)LBNSE-Flt3L和LBNSE-GM-CSF誘導(dǎo)的抗體水平在第四周均達(dá)到最高值,與親本毒株LBNSE相比,LBNSE-Flt3L與LBNSE-GM-CSF相似,均能更快地誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生更高滴度的抗體。另外,在重組狂犬病病毒免疫后的第二周,對(duì)免疫小鼠進(jìn)行了攻毒實(shí)驗(yàn),腦內(nèi)注射50LD50的CVS-24病毒,結(jié)果發(fā)現(xiàn)LBNSE-Flt3L的免疫保護(hù)率可達(dá)到80%,而LBNSE的免疫保護(hù)率則為45%。為進(jìn)一步研究細(xì)胞因子Flt3L增強(qiáng)狂犬病病毒免疫原性的作用機(jī)制,我們分離了小鼠骨髓源樹(shù)突狀細(xì)胞(DC),并感染LBNSE-Flt3L,利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了重組病毒LBNSE-Flt3L對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)的激活作用;同時(shí),還將LBNSE-Flt3L感染6周齡小鼠,同樣利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)其感染后DC的激活以及對(duì)生發(fā)中心(Germinal Center,GC)的B細(xì)胞的的促進(jìn)情況進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)無(wú)論是體外還是體內(nèi)實(shí)驗(yàn),與Mock組和親本毒株LBNSE相比,LBNSE-Flt3L均可以顯著激活DC,與LBNSE-GM-CSF效果相當(dāng),并能促進(jìn)更多GC B細(xì)胞的生成�？傊�,表達(dá)Flt3L的重組狂犬病病毒LBNSE-Flt3L可以通過(guò)激活DC和促進(jìn)GC B細(xì)胞的生成來(lái)增強(qiáng)免疫原性,提高抗病毒中和抗體的水平,從而提高了免疫保護(hù)率。本研究將為新型狂犬病疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：狂犬病 疫苗 Flt3L 中和抗體 樹(shù)突狀細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.65
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-9
• 縮略語(yǔ)表（Abbreviation）9-11
• 第一章 文獻(xiàn)綜述11-21
• 1.1 狂犬病概述11
• 1.2 狂犬病病原學(xué)11-12
• 1.3 狂犬病流行病學(xué)12-13
• 1.3.1 傳染源12
• 1.3.2 傳播途徑12-13
• 1.3.3 易感動(dòng)物13
• 1.3.4 流行情況13
• 1.4 狂犬病臨床診斷學(xué)13-14
• 1.4.1 臨床癥狀13-14
• 1.4.2 診斷14
• 1.5 狂犬病防控現(xiàn)狀14-15
• 1.5.1 國(guó)外防控現(xiàn)狀14-15
• 1.5.2 國(guó)內(nèi)防控現(xiàn)狀15
• 1.6 狂犬病病毒致病機(jī)制15-16
• 1.6.1 狂犬病病毒受體15
• 1.6.2 狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白對(duì)其致病性的影響15-16
• 1.7 狂犬病疫苗研究進(jìn)展16-18
• 1.7.1 常規(guī)疫苗16-17
• 1.7.2 新型疫苗17-18
• 1.8 Flt3L研究進(jìn)展18-21
• 1.8.1 Flt3L的結(jié)構(gòu)與特性18
• 1.8.2 Flt3L的生物學(xué)活性18-21
• 第二章 研究目的及意義21-22
• 第三章 材料與方法22-36
• 3.1 材料22-24
• 3.1.1 細(xì)胞、病毒、細(xì)菌及載體22
• 3.1.2 主要藥品及試劑22-23
• 3.1.3 主要相關(guān)試劑配制23
• 3.1.4 主要儀器與設(shè)備23-24
• 3.1.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物24
• 3.2 方法24-36
• 3.2.1 人源與鼠源Flt3L同源性的比較24
• 3.2.2 鼠源Flt3L基因的獲取24-26
• 3.2.3 重組狂犬病病毒LBNSE-Flt3L感染性克隆的構(gòu)建26-29
• 3.2.4 重組狂犬病病毒LBNSE-Flt3L的拯救29
• 3.2.5 重組狂犬病病毒LBNSE-Flt3L的鑒定29-30
• 3.2.6 重組狂犬病病毒LBNSE-Flt3L的擴(kuò)增30
• 3.2.7 重組狂犬病病毒LBNSE-Flt3L的滴定30
• 3.2.8 重組狂犬病病毒LBNSE-Flt3L的生長(zhǎng)曲線30
• 3.2.9 重組狂犬病病毒LBNSE-Flt3L的致病性實(shí)驗(yàn)30-31
• 3.2.10 重組狂犬病病毒LBNSE-Flt3L的免疫性及保護(hù)率實(shí)驗(yàn)31-32
• 3.2.11 小鼠樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）的體外分離與培養(yǎng)32-33
• 3.2.12 流式細(xì)胞術(shù)33-36
• 第四章 結(jié)果與分析36-50
• 4.1 人源與鼠源Flt3L同源性的比較36-37
• 4.2 鼠源Flt3L基因的獲取37-38
• 4.3 重組狂犬病病毒LBNSE-Flt3L感染性克隆的構(gòu)建38-39
• 4.4 重組狂犬病病毒LBNSE-Flt3L的鑒定39-40
• 4.4.1 免疫熒光檢測(cè)39
• 4.4.2 Flt3L的表達(dá)檢測(cè)39-40
• 4.5 重組狂犬病病毒LBNSE-Flt3L的生長(zhǎng)曲線40-41
• 4.6 重組狂犬病病毒LBNSE-Flt3L的致病性實(shí)驗(yàn)41
• 4.7 重組狂犬病病毒LBNSE-Flt3L的免疫性及保護(hù)率實(shí)驗(yàn)41-43
• 4.7.1 重組病毒免疫小鼠后中和抗體的測(cè)定41-42
• 4.7.2 重組病毒免疫小鼠后保護(hù)率實(shí)驗(yàn)42-43
• 4.8 重組狂犬病病毒LBNSE-Flt3L對(duì)DC的體外激活43-45
• 4.9 重組狂犬病病毒LBNSE-Flt3L對(duì)DC的體內(nèi)激活45-48
• 4.10 重組狂犬病病毒LBNSE-Flt3L對(duì)GC B的影響48-50
• 第五章 討論50-53
• 第六章 結(jié)論53-54
• 參考文獻(xiàn)54-61
• 致謝61

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 韓改會(huì);李回;孟先明;羅廷榮;;狂犬病病毒L蛋白的研究進(jìn)展[J];廣西畜牧獸醫(yī);2010年02期

2 張茂林;關(guān)振宏;段銘;黃英玉;王歡平;孟銳奇;;幾種糖對(duì)4℃貯存狂犬病病毒穩(wěn)定性的影響[J];中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào);2010年05期

3 梁秀梅，，于潛;狂犬病病毒和狂犬病[J];生物學(xué)通報(bào);1994年06期

4 陳鵬峰;也談犬與狂犬病[J];上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué);1995年02期

5 ;應(yīng)用免疫熒光抗體技術(shù)檢測(cè)豬的狂犬病病毒[J];農(nóng)業(yè)科技通訊;1997年09期

6 張海,金昌德,李六金,施新猷,婁清林,李秦;狂犬病病毒3aG株糖蛋白重組質(zhì)粒構(gòu)建及其體液免疫的研究[J];中國(guó)獸醫(yī)科技;2002年03期

7 姜海龍;錢(qián)愛(ài)東;;狂犬病病毒糖/核融合基因原核表達(dá)克隆質(zhì)粒的構(gòu)建與分析[J];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2005年06期

8 李影;段銳;錢(qián)愛(ài)東;;鹿源狂犬病野毒8202株基因型的研究[J];經(jīng)濟(jì)動(dòng)物學(xué)報(bào);2005年04期

9 張永振;熊成龍;鄒洋;王定明;余春;周敬祝;王昭孝;張永榮;;貴州省安龍縣狂犬病的流行病學(xué)研究[J];Virologica Sinica;2006年04期

10 王群亮;;淺析狂犬病防控工作出現(xiàn)的問(wèn)題及對(duì)策[J];科技信息(學(xué)術(shù)研究);2006年10期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 丁繼超;張海林;章域震;楊衛(wèi)紅;馮云;李浩;唐青;;云南省狂犬病病毒分子流行病學(xué)研究[A];2010全國(guó)狂犬病防控高層論壇論文集[C];2010年

2 羅廷榮;;廣西狂犬病流行現(xiàn)狀[A];2010全國(guó)狂犬病防控高層論壇論文集[C];2010年

3 周鵬;徐靜東;王曉娟;趙s

本文編號(hào)：985913