本文關(guān)鍵詞：牛早期胚胎發(fā)育中JPX影響XIST表達(dá)的研究

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【摘要】：在哺乳動(dòng)物中,雌雄個(gè)體之間為了達(dá)到X染色體上基因表達(dá)量的平衡,雌性個(gè)體會(huì)在早期胚胎發(fā)育過程中將其中一條X染色體失活(X Chromosome inactivation,XCI)。X染色體失活主要由X染色體失活中心(X Inactivation Center,XIC)介導(dǎo),而位于失活中心的X染色體特異性轉(zhuǎn)錄體(X-chromosome inactive special transcript,XIST)在X染色體失活過程中起到主要作用。近年來對(duì)XCI失活領(lǐng)域的不斷探索,發(fā)現(xiàn)了很多XIST的調(diào)節(jié)子。JPX在2002年被發(fā)現(xiàn),其編碼的長(zhǎng)非編碼RNA是在小鼠胚胎干細(xì)胞分化過程中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)XIST的激活子,JPX通過將XIST P2啟動(dòng)子上的絕緣子CTCF游離出來,解除絕緣子CTCF對(duì)XIST轉(zhuǎn)錄的抑制作用,從而促進(jìn)XIST的表達(dá),使得XCI正常進(jìn)行。敲除JPX基因?qū)Υ菩缘呐咛ジ杉?xì)胞具有致死性。然而,在胚胎的早期發(fā)育中JPX是否也能影響XIST的表達(dá),迄今無相關(guān)報(bào)道。本研究是在牛的早期胚胎中,采用體細(xì)胞核移植技術(shù)研究胚胎早期發(fā)育中JPX對(duì)XIST表達(dá)的影響。1、檢測(cè)牛早期胚胎不同發(fā)育階段中JPX和XIST的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)JPX和XIST在牛的2細(xì)胞胚胎、4細(xì)胞胚胎、8細(xì)胞胚胎、桑椹胚和囊胚中都有表達(dá),并且隨著胚胎發(fā)育相對(duì)表達(dá)量逐步升高。2、通過QRT-PCR分別檢測(cè)牛雌雄胎兒心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟組織中JPX和XIST的相對(duì)表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)JPX和XIST在雌性胎兒組織中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于雄性胎兒組織(P0.05)。3、根據(jù)NCBI上已知的牛JPX序列通過3'-RACE PCR擴(kuò)增技術(shù)將牛JPX 3'端全長(zhǎng)660 bp擴(kuò)增出來,通過測(cè)序獲得JPX 3'端全長(zhǎng)序列。4、構(gòu)建針對(duì)牛JPX的JPX-pcDNA?6.2-GW/EmGFP-miR干擾載體,QRT-PCR檢測(cè)到干擾效率為75%(P0.01),穩(wěn)轉(zhuǎn)雌性牛成纖維細(xì)胞,篩選出單細(xì)胞克隆。以獲得的單細(xì)胞克隆作為供核細(xì)胞,進(jìn)行體細(xì)胞核移植,并檢測(cè)JPX、XIST以及X連鎖基因的相對(duì)表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)當(dāng)JPX受到干擾后,相應(yīng)胚胎時(shí)期的XIST表達(dá)量顯著下降,但三個(gè)X連鎖基因PGK1、DYNLT3和MSN在囊胚階段的表達(dá)量顯著上調(diào)。在牛早期胚胎發(fā)育過程中,當(dāng)JPX RNA水平受到干擾后會(huì)下調(diào)XIST的表達(dá),進(jìn)而上調(diào)X-linked基因PGK1、DYNLT3和MSN的表達(dá)。
【關(guān)鍵詞】：早期胚胎發(fā)育 X染色體失活 JPX XIST 牛
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S823
【目錄】：

• 摘要6-7
• ABSTRACT7-11
• 文獻(xiàn)綜述11-35
• 第一章 X染色體失活和XIST的研究現(xiàn)狀11-27
• 1.1 X染色體失活11-19
• 1.1.1 X染色體失活的來源11-14
• 1.1.2 染色體失活中心14
• 1.1.3 減數(shù)分裂性染色體失活14-15
• 1.1.4 X印記失活15-16
• 1.1.5 X染色體的重新活化16
• 1.1.6 隨機(jī)失活16-18
• 1.1.7 失活的維持和基因的逃逸18-19
• 1.2 XIST的研究現(xiàn)狀19-27
• 1.2.1 XIST的簡(jiǎn)介19-20
• 1.2.2 XIST RNA的傳遞20-24
• 1.2.3 XIST介導(dǎo)多梳蛋白Polycomb的募集24-27
• 第二章 JPX的研究進(jìn)展27-35
• 2.1 JPX的發(fā)現(xiàn)27-28
• 2.2 JPX能夠逃避XCI28
• 2.3 JPX RNA作用形式28-30
• 2.4 JPX和TSIX具有拮抗性30-31
• 2.5 JPX RNA如何激活XIST的表達(dá)31-33
• 2.6 JPX對(duì)細(xì)胞的影響33-34
• 2.7 結(jié)束語和展望34-35
• 實(shí)驗(yàn)部分35-56
• 第三章 JPX和XIST在組織和早期胚胎中的表達(dá)模式35-42
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料35
• 3.1.1 牛胎兒和組織35
• 3.1.2 主要試劑35
• 3.1.3 主要儀器35
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法35-39
• 3.2.1 檢測(cè)組織中JPX和XIST的表達(dá)情況35-36
• 3.2.2 體外受精36-37
• 3.2.3 胚胎的性別鑒定37-38
• 3.2.4 檢測(cè)雌性早期胚胎中JPX和XIST的表達(dá)情況38-39
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果39-40
• 3.3.1 牛組織中JPX和XIST的表達(dá)情況39
• 3.3.2 胚胎的性別鑒定39-40
• 3.3.3 牛早期胚胎中JPX和XIST的表達(dá)情況40
• 3.4 討論40-41
• 3.5 小結(jié)41-42
• 第四章 牛早期胚胎中JPX對(duì)XIST表達(dá)的影響42-56
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料42-43
• 4.1.1 菌株和質(zhì)粒42
• 4.1.2 牛胎兒和卵巢42-43
• 4.1.3 主要試劑43
• 4.1.4 主要儀器43
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法43-50
• 4.2.1 成纖維細(xì)胞分離培養(yǎng)43-44
• 4.2.2 總RNA的提取44
• 4.2.3 3＇-RACE反應(yīng)擴(kuò)增牛JPX 3＇端全長(zhǎng)44-46
• 4.2.4 構(gòu)建JPX的干擾載體46
• 4.2.5 轉(zhuǎn)化46
• 4.2.6 質(zhì)粒測(cè)序鑒定46-47
• 4.2.7 無內(nèi)毒素質(zhì)粒的獲取47
• 4.2.8 單細(xì)胞克隆的制備47-48
• 4.2.9 載體干擾效率的檢測(cè)48
• 4.2.10 克隆胚的制備48-49
• 4.2.11 QRT-PCR檢測(cè)SCNT胚胎發(fā)育中JPX和XIST的相對(duì)表達(dá)量49-50
• 4.2.12 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析50
• 4.3 結(jié)果50-53
• 4.3.1 牛JPX 3＇-RACE擴(kuò)增結(jié)果50
• 4.3.2 干擾效率檢測(cè)結(jié)果50-51
• 4.3.3 單細(xì)胞克隆篩選結(jié)果51
• 4.3.4 陽性克隆的干擾效率檢測(cè)51
• 4.3.5 體細(xì)胞核移植胚胎的獲得51-52
• 4.3.6 SCNT胚胎中XIST的相對(duì)表達(dá)量52-53
• 4.4 討論53-55
• 4.5 小結(jié)55-56
• 全文總結(jié)56-57
• 參考文獻(xiàn)57-66
• 附錄66-69
• 致謝69-70
• 個(gè)人簡(jiǎn)介70

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