本文關(guān)鍵詞：白介素12真核表達(dá)質(zhì)粒及電穿孔對(duì)新城疫F基因DNA疫苗的免疫增強(qiáng)作用研究

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【摘要】：新城疫(Newcastle Disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)引起的一種高度接觸性、高死亡的禽類(lèi)傳染病,是危害養(yǎng)禽業(yè)的重要疫病。隨著近幾年基因Ⅶ型毒株的流行,使用傳統(tǒng)滅活苗和弱毒苗往往不能取得理想的免疫效果。因此,開(kāi)展新城疫基因工程疫苗的研究具有重要的意義。DNA疫苗被稱(chēng)為“第三代疫苗”,能夠刺激機(jī)體同時(shí)產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng),而且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng),是最具有潛力的基因工程苗之一。為了深入研究新城疫DNA疫苗,本研究利用含β-actin啟動(dòng)子和CMV增強(qiáng)子的載體質(zhì)粒pCAGGS成功構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pCAG-F和pCAG-IL12,通過(guò)電穿孔導(dǎo)入的方式將質(zhì)粒輸送到動(dòng)物體內(nèi),研究電穿孔免疫方式和雞IL12重組表達(dá)質(zhì)粒共免疫方式對(duì)pCAG-F DNA疫苗免疫原性的增強(qiáng)作用。首先,以基因Ⅶ型新城疫病毒CHICKEN/CH/GD/GM-03作為F基因的供體,在上游引入Kozak序列,構(gòu)建出pCAG-F真核表達(dá)質(zhì)粒,分別以電穿孔或者普通肌肉注射的方式免疫SPF雞群,通過(guò)檢測(cè)機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答水平,綜合評(píng)價(jià)電穿孔技術(shù)對(duì)新城疫DNA疫苗免疫原性的增強(qiáng)作用,并通過(guò)免疫保護(hù)試驗(yàn)對(duì)疫苗效果進(jìn)行評(píng)估。血清抗體中和試驗(yàn)結(jié)果顯示:在二免后2周pCAG-F/EP組的針對(duì)NDV GM株的中和抗體滴度高于pCAG-F/IM組。MTT法檢測(cè)免疫雞外周血T淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn),結(jié)果顯示:pCAG-F/IM組和EP組T淋巴細(xì)胞對(duì)CoA的刺激均有明顯的反應(yīng)性。二免后14 d,pCAG-F/IM組T細(xì)胞CoA刺激的OD值和對(duì)照組相比差異顯著(P0.05),而EP組T細(xì)胞CoA刺激的OD值和對(duì)照組相比差異極顯著(P0.001)。試驗(yàn)結(jié)果表明電穿孔的免疫方式能夠顯著增強(qiáng)新城疫F基因DNA疫苗的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答水平。二免后14 d進(jìn)行新城疫病毒強(qiáng)毒攻擊,pCAG-F/IM組存活率為90%,表明F基因作為新城疫基因的免疫原基因具有可行性。pCAG-F/EP組存活率為100%,說(shuō)明電穿孔的免疫方式能夠增強(qiáng)pCAG-F的攻毒保護(hù)效果。拭子病毒分離的結(jié)果表明,電穿孔的免疫方式能夠降低排毒率和縮短排毒時(shí)長(zhǎng)。其次,構(gòu)建表達(dá)雞源IL-12的真核表達(dá)質(zhì)粒,在電穿孔技術(shù)的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步探討分子佐劑IL-12對(duì)新城疫F基因DNA疫苗的免疫增強(qiáng)作用。血清中和抗體試驗(yàn)結(jié)果顯示:在三免后2周pCAG-F+pCAG-IL12/EP組和pCAG-F/EP組相比,中和抗體差異極顯著(P0.01)。MTT法檢測(cè)免疫雞外周血T淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn),結(jié)果顯示:二免后14 d,pCAG-F/EP組T細(xì)胞CoA刺激的OD值和對(duì)照組相比差異極顯著(P0.01),pCAG-F+pCAG-IL12/EP組T細(xì)胞CoA刺激的OD值和對(duì)照組相比差異極顯著(P0.001)。pCAG-F+pCAG-IL12/EP組和pCAG-F/EP組相比T細(xì)胞CoA刺激的OD值差異顯著(P0.05)。結(jié)果表明,pCAG-IL12質(zhì)粒能夠增強(qiáng)新城疫重組DNA疫苗pCAG-F的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。拭子病毒分離的結(jié)果表明,pCAG-F+pCAG-IL12/EP組僅第3 d時(shí),有1只雞(1/10)喉頭可分離到病毒,這說(shuō)明共免疫pCAG-IL12對(duì)重組DNA疫苗pCAG-F具有較明顯的免疫增強(qiáng)作用,能夠有效地抑制病毒在機(jī)體內(nèi)的復(fù)制和排毒。綜上,本研究制備了新城疫病毒F基因DNA疫苗,并評(píng)估了電穿孔基因?qū)爰夹g(shù)和使用pCAG-IL12質(zhì)粒作為佐劑均對(duì)新城疫pCAG-F DNA疫苗的免疫效果的影響,為新一代新城疫DNA疫苗的研制提供了新的思路和方向。
【關(guān)鍵詞】：新城疫 DNA疫苗 F基因 電穿孔 白介素12
【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S855.3
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-7
• 縮略語(yǔ)表(Abbreviation)7-11
• 1 前言11-22
• 1.1 新城疫及新城疫病毒概述11-13
• 1.1.1 新城疫概述11
• 1.1.2 新城疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白及功能11-13
• 1.2 新城疫疫苗研究進(jìn)展13-18
• 1.2.1 活疫苗13-14
• 1.2.2 滅活疫苗14
• 1.2.3 亞單位疫苗14-15
• 1.2.4 活載體疫苗15-16
• 1.2.5 病毒樣顆粒疫苗16-17
• 1.2.6 反向遺傳疫苗17
• 1.2.7 DNA疫苗17-18
• 1.3 DNA疫苗優(yōu)化策略18-21
• 1.3.1 密碼子優(yōu)化18-19
• 1.3.2 優(yōu)化載體19-20
• 1.3.3 選用合適的分子佐劑20
• 1.3.4 優(yōu)化接種途徑與接種方法20-21
• 1.4 IL-12作為免疫佐劑的作用及應(yīng)用21
• 1.5 本研究的目的和意義21-22
• 2 材料與方法22-33
• 2.1 材料22-24
• 2.1.1 病毒、質(zhì)粒和菌株22
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及攻毒試驗(yàn)場(chǎng)所22
• 2.1.3 主要試劑22-23
• 2.1.4 分子生物學(xué)軟件23
• 2.1.5 常用試劑的配制23-24
• 2.1.6 主要儀器和設(shè)備24
• 2.2 方法24-30
• 2.2.1 雞IL-12基因及新城疫F基因的克隆24-27
• 2.2.2 pCA-F和pCA-IL12質(zhì)粒的構(gòu)建、鑒定和準(zhǔn)備27-29
• 2.2.3 通過(guò)間接免疫熒光檢測(cè)目的蛋白表達(dá)29-30
• 2.3 攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)30-33
• 2.3.1 SPF雞的免疫30-32
• 2.3.2 血清中和試驗(yàn)32-33
• 2.3.3 淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)33
• 2.3.4 病毒分離33
• 3 結(jié)果與分析33-43
• 3.1 雞IL-12基因和GM株F基因擴(kuò)增結(jié)果33-34
• 3.2 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定34-36
• 3.2.1 pCAG-F和pCAG-IL12重組菌液PCR鑒定34-35
• 3.2.2 pCAG-F和pCAG-IL12重組菌液測(cè)序鑒定35
• 3.2.3 pCAG-F和pCAG-IL12重組質(zhì)粒酶切鑒定35-36
• 3.3 pCAG-F和pCAG-IL12重組質(zhì)粒在 293T細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)36-37
• 3.4 電穿孔技術(shù)對(duì)重組DNA疫苗pCAG-F免疫效果的影響37-40
• 3.4.1 病毒中和試驗(yàn)結(jié)果37-38
• 3.4.2 T淋巴細(xì)胞增殖結(jié)果38
• 3.4.3 攻毒保護(hù)效果及病毒排毒情況38-40
• 3.5 重組質(zhì)粒pCAG-IL12對(duì)重組DNA疫苗pCAG-F免疫效果的影響40-43
• 3.5.1 病毒中和試驗(yàn)結(jié)果40-41
• 3.5.2 T淋巴細(xì)胞增殖結(jié)果41
• 3.5.3 攻毒保護(hù)效果及病毒排毒情況41-43
• 4 討論43-46
• 4.1 關(guān)于新城疫F基因疫苗的討論43-44
• 4.2 關(guān)于電穿孔方法增強(qiáng)DNA疫苗作用的探討44-45
• 4.3 探討IL-12對(duì)DNA疫苗免疫增強(qiáng)作用45-46
• 5 結(jié)論46-47
• 致謝47-48
• 參考文獻(xiàn)48-53
• 附錄53

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前7條

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本文編號(hào)：936755