本文關(guān)鍵詞：miR-126-3p調(diào)控豬卵巢顆粒細胞功能的研究

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【摘要】：卵巢是哺乳動物重要的生殖腺,是卵泡發(fā)育和排卵的重要器官。卵泡是卵巢的結(jié)構(gòu)和功能單位,原始卵泡的正常募集、激活以及生長卵泡的發(fā)育、排卵是保障母豬終身繁殖力的前提。卵泡的發(fā)育過程伴隨著顆粒細胞生長、發(fā)育和分化,顆粒細胞的增殖和凋亡與卵泡發(fā)育卵母細胞的成長發(fā)育、原始卵泡生長的啟動、生長期卵泡發(fā)育的調(diào)控以及卵泡閉鎖密切相關(guān)。眾多研究表明顆粒細胞相關(guān)基因和miRNA影響著顆粒細胞功能,進而影響卵泡生長發(fā)育。本課題組前期通過對青春期前和疑似卵巢早衰(Premature ovarian failure,POF)后備母豬卵巢組織進行了miRNA表達譜分析,獲得了與卵泡發(fā)育相關(guān)的miRNAs,篩選了在疑似POF后備母豬卵巢高表達的miR-126-3p為候選miRNA。本研究運用Annexin V-FITC流式檢測、Edu熒光顯微鏡檢測、qRT-PCR和Western Blot等實驗技術(shù)對miR-126-3p細胞生物學功能、靶基因生物學功能及其對顆粒細胞功能影響。研究結(jié)果對深入了解母豬卵巢顆粒細胞對卵泡發(fā)育分子機制奠定基礎(chǔ),對進一步了解卵巢卵泡發(fā)育的分子調(diào)控機制以及對畜牧生產(chǎn)的經(jīng)濟效益的提高具有重要意義。本研究結(jié)果具體如下:1.Annexin V-FITC流式檢測結(jié)果表明,miR-126-3p能夠抑制顆粒細胞凋亡。運用Edu熒光顯微鏡檢測結(jié)果表明,miR-126-3p能夠促進顆粒細胞增殖。2.生物信息學預測miR-126-3p靶向原始卵泡激活和休眠相關(guān)PI3K-AKT通路中的關(guān)鍵基因PIK3R2和TSC1。進一步通過雙熒光報告基因驗證該miRNA能夠結(jié)合PIK3R2 3’UTR和TSC1 3’UTR抑制報告基因表達;qRT-PCR和Western blotting結(jié)果表明miR-126-3p能夠在轉(zhuǎn)錄后水平負調(diào)控PIK3R2,在翻譯水平負調(diào)控PIK3R2和TSC1的表達。3.Annexin V-FITC和Edu檢測表明,抑制PIK3R2和TSC1后(轉(zhuǎn)染siRNA-PIK3R2和siRNA-TSC1)能夠抑制顆粒細胞凋亡,而促進顆粒細胞增殖。補充外源的siRNA-PIK3R2和siRNA-TSC1則能夠減弱抑制miR-126-3p引起的促進顆粒細胞凋亡作用和回復抑制miR-126-3p引起的抑制顆粒細胞增殖作用。4.通過qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染siRNA-PIK3R2和siRNA-TSC1后所在PI3K通路上下游基因的表達變化。檢測結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染siRNA-PIK3R2使得IGF1R、INRS、PDK1和AKT1表達量下降,而IRS1表達量上升;PTEN表達量變化不明顯。轉(zhuǎn)染siRNA-TSC1后使得PTEN、AKT1、TSC2、rpS6和mTOR表達量上升,而PDK1表達量變化不明顯。上述結(jié)果揭示了miR-126-3p能夠通過PIK3R2和TSC1抑制豬卵巢顆粒細胞凋亡和促進顆粒細胞增殖,為深入了解miRNA調(diào)控卵巢卵泡發(fā)育提供借鑒,同時也為后續(xù)研究PIK3-AKT通路在卵巢顆粒細胞中的研究奠定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：豬 顆粒細胞 miR-126-3p PIK3R2 TSC1
【學位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S828
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-9
• 1 前言9-15
• 1.1 哺乳動物卵巢結(jié)構(gòu)與功能9-10
• 1.2 顆粒細胞對卵泡發(fā)育過程的調(diào)控研究10-12
• 1.3 miRNA調(diào)控卵巢功能的研究進展12-13
• 1.4 miR-126 調(diào)控卵巢功能的研究進展13-14
• 1.5 研究目的與意義14
• 1.6 技術(shù)路線14-15
• 2 材料與方法15-33
• 2.1 實驗材料15-17
• 2.1.1 實驗樣品15
• 2.1.2 實驗儀器設備15-16
• 2.1.3 主要試劑16-17
• 2.1.4 試劑配制17
• 2.2 實驗方法17-33
• 2.2.1 總RNA的提取17-18
• 2.2.2 總RNA檢測及反轉(zhuǎn)錄18-20
• 2.2.3 q RT-PCR檢測20-22
• 2.2.4 豬卵巢顆粒細胞原代和傳代培養(yǎng)22-23
• 2.2.5 豬卵巢顆粒細胞的接種和轉(zhuǎn)染23-24
• 2.2.6 豬卵巢顆粒細胞凋亡檢測24
• 2.2.7 豬卵巢顆粒細胞增殖檢測24-25
• 2.2.8 靶基因PIK3R2、TSC1的預測25
• 2.2.9 構(gòu)建靶基因雙熒光素酶報告載體25-32
• 2.2.10 雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測32
• 2.2.11 Western Blot32-33
• 3 結(jié)果與分析33-50
• 3.1 miR1263p對豬卵巢顆粒細胞功能的影響33-36
• 3.1.1 miR1263p小片段效率檢測33-34
• 3.1.2 miR1263p抑制豬卵巢顆粒細胞凋亡34-35
• 3.1.3 miR1263p促進豬卵巢顆粒細胞增殖35-36
• 3.2 miR1263p靶基因的預測及驗證36-43
• 3.2.1 靶基因生物信息學分析36-37
• 3.2.2 構(gòu)建靶基因雙熒光素酶報告載體、突變載體及缺失載體37-40
• 3.2.3 靶基因雙熒光活性檢測40-41
• 3.2.4 qRT-PCR檢測miR1263p對靶基因轉(zhuǎn)錄水平的影響41-42
• 3.2.5 Western Blot檢測miR1263p對靶基因蛋白水平的影響42-43
• 3.3 靶基因TSC1、PIK3R2對豬卵巢顆粒細胞功能的影響43-48
• 3.3.1 siPIK3R2、siTSC1干擾效率檢測43-44
• 3.3.2 干擾PIK3R2、干擾TSC1抑制豬卵巢顆粒細胞凋亡44-45
• 3.3.3 干擾PIK3R2、干擾TSC1促進豬卵巢顆粒細胞增殖45-46
• 3.3.4 干擾PIK3R2檢測其通路上下游基因的表達46-47
• 3.3.5 干擾TSC1檢測其通路上下游基因的表達47-48
• 3.4 miR1263p靶基因PIK3R2、TSC1功能回復驗證48-50
• 3.4.1 靶基因PIK3R2、TSC1細胞凋亡回復驗證48-49
• 3.4.2 靶基因PIK3R2、TSC1細胞增殖回復驗證49-50
• 4 討論與結(jié)論50-59
• 4.1 miRNA對豬卵巢顆粒細胞功能調(diào)控50-52
• 4.2 miRNA靶基因的預測與驗證52-54
• 4.3 PIK3R2、TSC1在豬卵巢中的研究54-57
• 4.4 miR1263p靶基因PIK3R2、TSC1功能回復驗證57
• 4.5 結(jié)論57-59
• 致謝59-60
• 參考文獻60-67

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前7條

1 劉卓琦;萬福生;羅達亞;;miRNA靶基因的篩選方法及其相關(guān)網(wǎng)絡資源[J];中國生物化學與分子生物學報;2015年02期

2 葉娜;董曉英;李冬華;;卵巢早衰的顆粒細胞凋亡機制研究進展[J];首都醫(yī)科大學學報;2014年03期

3 ;An update on primary ovarian insufficiency[J];Science China(Life Sciences);2012年08期

4 ;Current Advances in Epigenetic Modification and Alteration during Mammalian Ovarian Folliculogenesis[J];遺傳學報;2012年03期

5 周瑩;朱英哲;張素華;王紅梅;王樹玉;楊曉葵;;卵巢早衰microRNA的差異表達及其作用[J];中國優(yōu)生與遺傳雜志;2011年05期

6 丁愛軍;蘇雷;;哺乳動物卵泡閉鎖的研究[J];中國畜禽種業(yè);2007年06期

7 田允波;曾書琴;陳學進;施振旦;;哺乳動物原始卵泡生長啟動的調(diào)控[J];農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報;2006年04期

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本文編號：933572