本文關(guān)鍵詞：旋毛蟲谷氨酸脫羧酶TsGAD的表達(dá)和定位及不同pH對(duì)其影響的研究

  更多相關(guān)文章： 旋毛蟲肌幼蟲 谷氨酸脫羧酶(GAD) 原核表達(dá) 抗酸性 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

【摘要】：旋毛蟲病是由旋毛形線蟲(Trichinella spiralis)引起的一種危害嚴(yán)重的人獸共患線蟲病。宿主通過攝入含有感染性肌幼蟲的肉而致病,富含旋毛蟲包囊的肉被哺乳動(dòng)物吞食后,在胃酸的作用下,肌肉組織在胃內(nèi)消化,感染性肌幼蟲被釋放出來。旋毛蟲作為一種食源性病原體,其生活史決定了旋毛蟲肌幼蟲需經(jīng)過哺乳動(dòng)物的胃這一極酸性環(huán)境進(jìn)而導(dǎo)致宿主發(fā)病,但其是否存在與大腸桿菌相似的抗酸機(jī)制,現(xiàn)尚未見報(bào)道。已有研究結(jié)果證實(shí),谷氨酸在旋毛蟲體內(nèi),尤其是肌幼蟲含量很高,并且旋毛蟲谷氨酸脫羧酶(GAD)基因序列已發(fā)表可查,所以我們推測(cè)旋毛蟲肌幼蟲中也可能具有類似的谷氨酸依賴型抗酸系統(tǒng)。本文根據(jù)GenBank上TsGAD的基因編碼序列設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的特異性引物,提取旋毛蟲肌幼蟲總RNA,采用RT-PCR方法得到c DNA后,以c DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,然后將PCR產(chǎn)物與p MD18-T載體連接后轉(zhuǎn)入克隆感受態(tài)DH5α,經(jīng)過PCR和Hind III、Bam HⅠ雙酶切、測(cè)序后,將鑒定正確的目的片段與表達(dá)載體pET-30a(+)連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中,利用誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá),通過對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化,采用1mol/L IPTG,于37°C誘導(dǎo)5h是表達(dá)效果最為理想的條件,經(jīng)SDS-PAGE分析目的蛋白出現(xiàn)于57k Da左右,目的蛋白主要以包涵體形式存在,分子量約為57KDa,與預(yù)測(cè)的理論值相符。實(shí)驗(yàn)采用比色法測(cè)定TsGAD重組蛋白活性,結(jié)果顯示TsGAD具有酶活性,活性大小為1.5U,說明通過復(fù)性得到正確折疊結(jié)構(gòu)的Ts GAD蛋白。將純化的重組蛋白多位點(diǎn)免疫新西蘭大白兔,制備多克隆抗體,獲得免疫多抗血清,用Western Blot方法對(duì)免疫原性進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,多克隆抗血清作為抗體可以識(shí)別重組蛋白并與之結(jié)合。利用間接ELISA方法檢測(cè)獲得的多抗效價(jià),結(jié)果表明,獲得的多抗效價(jià)達(dá)到1:65536,該重組蛋白具有良好的免疫原性和反應(yīng)原性,并且特異性高;免疫熒光定位試驗(yàn)結(jié)果證明,Ts GAD分布于旋毛蟲肌幼蟲蟲體體表。根據(jù)Gen Bank中發(fā)表的旋毛蟲的TsGAD和TsGAPDH基因序列,設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光引物,建立熒光定量PCR檢測(cè)方法。利用建立的Ts GAD實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法,將p H設(shè)置4個(gè)梯度,分別為p H 2.5、pH 4.0、pH 6.6和p H 9.0,為了檢測(cè)不同p H條件下培養(yǎng)的旋毛蟲肌幼蟲Ts GAD m RNA的表達(dá)水平。研究結(jié)果顯示,隨著pH值的降低,Ts GAD mRNA表達(dá)量逐漸升高,在p H 2.5時(shí)Ts GAD mRNA表達(dá)量顯著高于pH 4.0、p H 6.6和p H 9.0(p0.05);同樣將培養(yǎng)時(shí)間設(shè)置3個(gè)梯度,分別是0.5h、1h和3h,此時(shí)Ts GAD的mRNA相對(duì)表達(dá)量也不同,培養(yǎng)1h的表達(dá)量高于培養(yǎng)0.5h和3h。研究結(jié)果表明,極酸環(huán)境能顯著誘導(dǎo)Ts GAD mRNA的表達(dá),我們推測(cè)Ts GAD在酸性條件下具有抗酸性,TsGAD可能參與旋毛蟲與宿主之間的抗酸過程,這為進(jìn)一步研究旋毛蟲的谷氨酸依賴型抗酸機(jī)理提供依據(jù),還為以后預(yù)防、治療及診斷旋毛蟲病奠定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：旋毛蟲肌幼蟲 谷氨酸脫羧酶(GAD) 原核表達(dá) 抗酸性 實(shí)時(shí)熒光定量PCR
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.7
【目錄】：

• 摘要8-9
• 英文摘要9-11
• 1 引言11-18
• 1.1 旋毛蟲病及旋毛蟲生活史11
• 1.2 谷氨酸脫羧酶概況11-13
• 1.2.1 GAD的來源及用途11-12
• 1.2.2 GAD的酶學(xué)性質(zhì)12
• 1.2.3 GAD的分子生物學(xué)研究12-13
• 1.2.4 GAD酶活力的測(cè)定13
• 1.3 γ-氨基丁酸（GABA）13
• 1.3.1 GABA理化性質(zhì)及應(yīng)用13
• 1.3.2 GABA的制備13
• 1.4 常見胃腸道致病菌抗酸機(jī)制的研究進(jìn)展13-17
• 1.4.1 大腸桿菌的抗酸機(jī)制14-15
• 1.4.2 沙門氏菌的抗酸機(jī)制15-16
• 1.4.3 志賀式桿菌的抗酸機(jī)制16
• 1.4.4 弧菌的抗酸機(jī)制16
• 1.4.5 乳酸乳球菌的抗酸機(jī)制16-17
• 1.4.6 單增李斯特菌的抗酸機(jī)制17
• 1.5 研究的目的和意義17-18
• 2 材料與方法18-29
• 2.1 材料18-19
• 2.1.1 蟲株18
• 2.1.2 主要試劑18
• 2.1.3 主要儀器設(shè)備18-19
• 2.1.4 主要應(yīng)用軟件19
• 2.2 方法19-29
• 2.2.1 旋毛蟲肌幼蟲的收集19
• 2.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成19
• 2.2.3 總RNA的提取19
• 2.2.4 逆轉(zhuǎn)錄19-20
• 2.2.5 TsGAD基因的克隆20-22
• 2.2.6 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建22-23
• 2.2.7 TsGAD重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)23-24
• 2.2.8 比色法測(cè)定酶活性24
• 2.2.9 TsGAD蛋白的抗原性檢測(cè)24-25
• 2.2.10 TsGAD蛋白熒光免疫定位25-26
• 2.2.11 pH對(duì)旋毛蟲肌幼蟲TsGAD mRNA表達(dá)水平的影響26-28
• 2.2.12 肌幼蟲體外存活率的檢測(cè)28-29
• 3 結(jié)果29-41
• 3.1 TsGAD基因克隆結(jié)果29
• 3.1.1 旋毛蟲肌幼蟲TsGAD擴(kuò)增29
• 3.1.2 重組克隆質(zhì)粒p MD18-T-Ts GAD的鑒定29
• 3.2 誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果29-32
• 3.2.1 重組質(zhì)粒pET-30a-Ts GAD的鑒定29-30
• 3.2.2 重組蛋白表達(dá)時(shí)相及可溶性分析30-31
• 3.2.3 pET-30a-GAD重組蛋白誘導(dǎo)條件的優(yōu)化31-32
• 3.3 TsGAD酶活性的檢測(cè)32-33
• 3.4 多克隆抗體效價(jià)的測(cè)定33
• 3.5 重組蛋白Western Blot檢測(cè)結(jié)果33-34
• 3.6 TsGAD蛋白熒光免疫定位34
• 3.7 不同pH對(duì)旋毛蟲肌幼蟲TsGAD mRNA表達(dá)水平的影響34-41
• 3.7.1 RT-TsGAD基因和內(nèi)參RT-Ts GAPDH基因片段的擴(kuò)增34
• 3.7.2 標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建34-36
• 3.7.3 RT-TsGAD、RT-TsGAPDH熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立36-38
• 3.7.4 pH對(duì)TsGAD mRNA表達(dá)水平的影響38
• 3.7.5 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)TsGAD mRNA表達(dá)水平的影響38
• 3.7.6 肌幼蟲存活率的檢測(cè)38-41
• 4 討論41-44
• 4.1 TsGAD基因的原核表達(dá)41
• 4.2 TsGAD酶活性的測(cè)定及免疫相關(guān)性的分析41
• 4.3 不同pH對(duì)旋毛蟲肌幼蟲TsGAD mRNA表達(dá)水平的影響41-43
• 4.4 本實(shí)驗(yàn)的創(chuàng)新之處43-44
• 5 結(jié)論44-45
• 致謝45-46
• 參考文獻(xiàn)46-51
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文51

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 C. Ram ,高安娜;谷氨酸脫羧酶活性與小麥的田間性狀[J];麥類作物學(xué)報(bào);1989年04期

2 楊勝遠(yuǎn);陸兆新;孫力軍;呂鳳霞;別小妹;劉戰(zhàn)民;;爬山虎內(nèi)生菌的鑒定及其谷氨酸脫羧酶酶學(xué)特性[J];南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2007年02期

3 范軍,李培金,李純,稽躍琴,陸翠珍;谷氨酸脫羧酶親和層析介質(zhì)制備[J];西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2001年01期

4 胡偉;楊曉穎;李美英;王卓;徐碧玉;金志強(qiáng);;香蕉谷氨酸脫羧酶基因克隆與表達(dá)[J];西北植物學(xué)報(bào);2009年03期

5 戴鳳燕;繆冶煉;陳介余;米朕;;香蕉成熟過程中谷氨酸脫羧酶活力的變化規(guī)律[J];中國(guó)食品學(xué)報(bào);2010年06期

6 于善新 ,孫中瑞;不同大小的花生種子代謝活性的差異[J];花生科技資料;1973年04期

7 林謙;姜康怡;韋素娟;郭丹妮;農(nóng)石蓉;高敏;;產(chǎn)GABA發(fā)酵乳桿菌的篩選、發(fā)酵條件優(yōu)化及其谷氨酸脫羧酶基因的克隆[J];廣東農(nóng)業(yè)科學(xué);2014年08期

8 陳蔚青,朱力,樓東平;提高L-谷氨酸脫羧酶產(chǎn)量與穩(wěn)定活力的研究[J];浙江農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);1998年03期

9 穆小民,楊曉賀,吳顯榮,沈黎明;林生山黧豆谷氨酸脫羧酶的性質(zhì)及其比較研究[J];中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);1999年03期

10 白青云;曾波;顧振新;;發(fā)芽粟谷中谷氨酸脫羧酶的主要酶學(xué)性質(zhì)初探[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2011年03期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 蔣春雷;李泉;李潤(rùn)平;孫學(xué)軍;劉昀;;急性氧中毒機(jī)制——高分壓氧對(duì)谷氨酸脫羧酶含量的影響[A];救撈專業(yè)委員會(huì)2004年學(xué)術(shù)交流會(huì)論文集[C];2004年

2 李春林;王尚珍;劉瑞蓮;;成人隱匿性自身免疫性糖尿病的臨床特點(diǎn)——91例谷氨酸脫羧酶抗體檢測(cè)結(jié)果和臨床資料分析[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第六次全國(guó)內(nèi)分泌學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2001年

3 董元祥;陳濤;李云慶;;大鼠導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)內(nèi)谷氨酸脫羧酶和阿片μ受體陽性神經(jīng)元與亮氨酸-腦啡肽、β-內(nèi)啡肽和強(qiáng)啡肽陽性終末的聯(lián)系[A];解剖學(xué)雜志——中國(guó)解剖學(xué)會(huì)2002年年會(huì)文摘匯編[C];2002年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 郁凱;以計(jì)算機(jī)輔助分子設(shè)計(jì)方法改造谷氨酸脫羧酶的研究[D];浙江大學(xué);2013年

2 張暉;米胚谷氨酸脫羧酶性質(zhì)及其富集γ-氨基丁酸研究[D];江南大學(xué);2004年

3 林謙;嗜熱鏈球菌Y2谷氨酸脫羧酶基因的克隆與表達(dá)[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 丁偉;谷氨酸脫羧酶重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建及其發(fā)酵優(yōu)化[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2015年

2 唐銘澤;污染湖泊宏基因組文庫中谷氨酸脫羧酶基因的克隆及功能研究[D];廣西大學(xué);2015年

3 高曉彤;生產(chǎn)GABA乳酸菌的篩選及其相關(guān)特性研究[D];山東大學(xué);2015年

4 欒建軍;植物乳桿菌谷氨酸脫羧酶的克隆表達(dá)以及酶性質(zhì)的初步研究[D];昆明理工大學(xué);2013年

5 時(shí)粲;植物乳桿菌谷氨酸脫羧酶的原核表達(dá)及其酶學(xué)性質(zhì)研究[D];廣西科技大學(xué);2015年

6 王潔;重組GAD清酒酵母合成GABA條件優(yōu)化與穩(wěn)定[D];長(zhǎng)江大學(xué);2016年

7 王澤;旋毛蟲谷氨酸脫羧酶TsGAD的表達(dá)和定位及不同pH對(duì)其影響的研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

8 邱文軍;產(chǎn)谷氨酸脫羧酶菌株篩選及生產(chǎn)γ-氨基丁酸的研究[D];江南大學(xué);2014年

9 張珂;谷氨酸脫羧酶轉(zhuǎn)化制備γ-氨基丁酸工藝的研究[D];安徽工程大學(xué);2012年

10 陳煙蘭;產(chǎn)谷氨酸脫羧酶真菌的篩選及酶的分離純化[D];福建師范大學(xué);2014年

，

本文編號(hào)：929562