本文關鍵詞：白藜蘆醇對小鼠精原干細胞生物學特性的影響

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【摘要】：精原干細胞(Spermatogonial stem cells,SSCs)是位于雄性動物睪丸基底膜上由支持細胞等體細胞所構成的微環(huán)境中的一類干細胞。它具有干細胞的典型特征:自我更新和分化。在維持自身數(shù)量相對穩(wěn)定的同時,通過精子發(fā)生源源不斷地產(chǎn)生大量的精子。精原干細胞是成年雄性哺乳動物體內唯一傳遞遺傳和表觀信息的一類成體干細胞。隨著年齡的不斷增長,精原干細胞所處微環(huán)境穩(wěn)態(tài)被破壞,結合其自身在受到氧化應激等損傷并不斷積累,精原干細胞自我更新與分化功能逐漸衰退,睪丸中精原干細胞池日益枯竭,精子數(shù)量和質量也隨之驟減,雄性動物生育力下降。白藜蘆醇是一種多酚類植物抗毒素,可以模擬熱量限制延長酵母、線蟲及果蠅等生物的壽命。在小鼠食物中添加白藜蘆醇時,可以通過激活SIRT1蛋白,有效緩解衰老導致的功能衰退,也可以抵抗高脂飲食對機體器官的損傷。白藜蘆醇的作用具有組織和劑量特異性。它還可以作為化療藥物通過線粒體、p53或BCL2等途徑誘導肝癌、胃癌、結腸癌等癌細胞的凋亡,抑制癌癥的發(fā)生、發(fā)展和惡化。在嘗試使用白藜蘆醇緩解衰老對精原干細胞造成的損傷同時,應首先確定有效的工作濃度,探究白藜蘆醇對精原干細胞是否有副作用及相關機制,避免二次損傷。白消安是骨髓移植前最常用的清髓藥物,也是癌癥治療過程中化療藥物的一種。作為一種烷化劑,白消安主要通過引起細胞內ROS水平升高和DNA-DNA、DNA-蛋白、蛋白-蛋白交聯(lián)等,破壞遺傳物質穩(wěn)定性,誘導凋亡發(fā)生。與衰老作用機制相似,白消安在臨床應用過程中發(fā)現(xiàn)具有較強生殖毒性,并依此建立小鼠無精癥模型,為精原干細胞移植和自我更新、分化以及衰老的研究奠定基礎。本研究首先鑒定體外培養(yǎng)小鼠精原干細胞系C18-4的生物學特性,再檢測不同濃度白藜蘆醇對其細胞活力、增殖和凋亡水平的影響,并進一步經(jīng)過線粒體膜電位、SIRT1-FOXO1信號通路和DNA完整性等實驗探究各濃度白藜蘆醇的作用機制,為初步探索白藜蘆醇干預白消安引起的精原干細胞損傷實驗提供參照。本試驗為白藜蘆醇對化療或者衰老過程中雄性生育能力保護的研究奠定基礎。1.白藜蘆醇對小鼠精原干細胞系C18-4生物學特性的影響經(jīng)過形態(tài)學和免疫熒光染色方法觀察C18-4細胞呈圓形或橢圓形、核質比高,表達PLZF、NANOS2、VASA、SSEA1、CD49f,不表達STRA8等A型精原干細胞的典型特征。2μM白藜蘆醇可促進C18-4細胞活力,但隨著濃度升高,C18-4細胞活力逐漸下降。20μM將C18-4細胞增殖阻滯在S期,而當濃度升至200μM時,C18-4細胞核皺縮,細胞空泡化,增殖被抑制,凋亡率顯著升高。2.初步探究不同濃度白藜蘆醇對小鼠精原干細胞的作用機理線粒體膜電位檢測表明2μM白藜蘆醇可以保護線粒體完整性,促進能量代謝。而20μM和200μM劑量的白藜蘆醇損傷線粒體功能。在200μM處理后DNA雙鏈發(fā)生斷裂,加劇C18-4細胞凋亡的發(fā)生。隨著白藜蘆醇濃度的升高,SIRT1蛋白表達量也逐漸增多,降低FOXO1的乙�；揎椝�,且在小鼠精原干細胞內FOXO1蛋白從核、質分布逐漸集中到細胞核分布。凋亡相關蛋白p38表達量與白藜蘆醇濃度正相關,而抗凋亡蛋白BCL2在2μM白藜蘆醇刺激下表達量升高,200μM時BCL2表達受抑制,促進凋亡的發(fā)生。3.白藜蘆醇促進小鼠無精癥模型精原干細胞的恢復白消安腹腔注射4周后,小鼠睪丸中曲細精管精原干細胞位置呈空泡化,附睪中精子完全消失。當進行白藜蘆醇干預時,可以促進精原干細胞的恢復,其中100 mg/kg/d劑量的白藜蘆醇作用最明顯,此時附睪中可以觀察到精子存在。實時熒光定量PCR檢測表明,白藜蘆醇可以抑制凋亡相關基因p53、c-Myc和FoxO1的轉錄,而精原干細胞的標記基因Thy1、Plzf表達量相對升高,分化標記基因c-Kit和支持細胞標記基因Sox9表達量相對下降,增殖標記基因Pcna表達量上調。說明白藜蘆醇可以通過抑制精原干細胞凋亡,促進增殖,從而增強其在白消安受損后的恢復能力。Western-Blotting檢測顯示白藜蘆醇干預后SIRT1蛋白顯著性上調,并去乙酰化下游FOXO1蛋白。
【關鍵詞】：精原干細胞 白藜蘆醇 凋亡 SIRT1 衰老
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S859.7
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-14
• 第一章 文獻綜述14-26
• 1.1 精原干細胞研究進展14-18
• 1.1.1 精原干細胞的定義與生物學特性15-16
• 1.1.2 精原干細胞自我更新機制的研究16-17
• 1.1.3 精原干細胞衰老的研究17-18
• 1.2 白藜蘆醇的研究進展18-24
• 1.2.1 白藜蘆醇的來源與理化性質19-20
• 1.2.2 白藜蘆醇與衰老20-24
• 1.3 小結與展望24-26
• 第二章 不同濃度白藜蘆醇對小鼠精原干細胞活力的影響26-38
• 2. 引言26
• 2.1 材料26-27
• 2.1.1 實驗材料26
• 2.1.2 主要試劑26-27
• 2.1.3 主要儀器與耗材27
• 2.2 方法27-32
• 2.2.1 主要溶液的配制27-29
• 2.2.2 C18-4 細胞的復蘇、傳代培養(yǎng)與凍存29-30
• 2.2.3 貼壁細胞免疫熒光染色30
• 2.2.4 CCK-8 檢測細胞活力30
• 2.2.5 Giemsa染色30
• 2.2.6 細胞凋亡率的測定30-31
• 2.2.7 BrdU染色31
• 2.2.8 細胞周期的測定31-32
• 2.3 結果32-36
• 2.3.1 C18-4 細胞的生物學特性32-33
• 2.3.2 不同濃度白藜蘆醇對C18-4 細胞活力的影響33-34
• 2.3.4 不同濃度白藜蘆醇對C18-4 凋亡水平的影響34-35
• 2.3.5 不同濃度白藜蘆醇對C18-4 增殖周期的影響35-36
• 2.4 討論36
• 2.5 小結36-38
• 第三章 不同濃度白藜蘆醇對小鼠精原干細胞作用機理的研究38-47
• 3.1 材料38-39
• 3.1.1 實驗材料38
• 3.1.2 主要試劑38-39
• 3.1.3 主要儀器與耗材39
• 3.2 方法39-40
• 3.2.1 線粒體膜電位檢測39
• 3.2.2 Western-Blotting39-40
• 3.2.3 貼壁細胞免疫熒光染色40
• 3.3 結果40-45
• 3.3.1 白藜蘆醇對小鼠精原干細胞線粒體膜電位的影響40-42
• 3.3.2 白藜蘆醇影響小鼠精原干細胞內SIRT1蛋白的表達和定位42-43
• 3.3.3 白藜蘆醇影響小鼠精原干細胞內FOXO1蛋白的表達和定位43-44
• 3.3.4 高濃度白藜蘆醇引起小鼠精原干細胞DNA雙鏈斷裂44-45
• 3.3.5 不同濃度白藜蘆醇處理后相關蛋白表達水平變化45
• 3.4 討論45-46
• 3.5 小結46-47
• 第四章 白藜蘆醇促進無精癥模型小鼠精原干細胞的恢復47-54
• 4.1 材料47
• 4.1.1 實驗材料47
• 4.1.2 主要試劑47
• 4.1.3 主要儀器與耗材47
• 4.2 方法47-49
• 4.2.1 主要溶液的配制47-48
• 4.2.2 白消安誘導無精癥小鼠模型的構建48
• 4.2.3 白藜蘆醇干預48
• 4.2.4 H&E染色48
• 4.2.5 熒光實時定量PCR48-49
• 4.2.6 Western-Blotting檢測49
• 4.3 結果49-52
• 4.3.1 白藜蘆醇可以促進白消安損傷后精原干細胞的恢復49-50
• 4.3.2 白藜蘆醇對無精癥小鼠中相關基因表達的影響50-52
• 4.3.3 白藜蘆醇可以通過激活SIRT1促進精原干細胞的恢復52
• 4.4 討論52-53
• 4.5 小結53-54
• 結論54
• 本文研究的創(chuàng)新點及進一步研究的課題54-55
• 參考文獻55-68
• 致謝68-70
• 作者簡介70

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