本文關鍵詞：藍舌病毒感染細胞（A.albopictus和PST）miRNA表達譜的鑒定與功能分析

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【摘要】：藍舌病(Bluetongue)是由藍舌病毒(Bluetongue virus,BTV)引起的以媒介昆蟲庫蠓為主要傳播媒介的一種非接觸性傳染病,其易感動物為綿羊、山羊、牛和鹿等反芻動物。藍舌病的暴發(fā)經(jīng)常給家畜養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失,因此世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為必須上報的動物傳染病。BTV隸屬于呼腸孤病毒科(Reoviridae)環(huán)狀病毒屬(Orbivirus)。microRNA(miRNA)是大小約為19-25個核苷酸具有調(diào)控功能的一類非編碼單鏈小RNA。近年來研究表明,miRNA在病原-媒介-宿主相互作用過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用,可通過調(diào)控靶基因的表達影響病毒的感染與復制,在宿主細胞的免疫調(diào)控和抗病毒反應中發(fā)揮重要作用。目前,人們對BTV與細胞相互作用的理解非常有限,細胞miRNA在BTV感染過程中的作用仍不清楚。本研究首先利用Solexa高通量測序技術對BTV感染的白紋伊蚊(Aedes albopictus,A.albopictus)細胞和原代綿羊睪丸(primary sheep testis,PST)細胞及其未感染樣品進行miRNA測序,借助生物信息學技術對差異表達miRNA及其靶基因進行功能注釋和分析,通過實時定量PCR方法對部分差異miRNA和靶基因的表達豐度進行了驗證。同時選擇了三個表達差異的miRNA,對其在BTV復制過程中的作用機制進行了初步研究,結果如下:1.BTV感染A.albopictus細胞組和對照組經(jīng)高通量測序獲得11,206,854和12,125,274個可信序列標簽,分別含89和92個已知miRNA,266和181個新預測miRNA。兩組之間有15個已知miRNA和125個新miRNA發(fā)生顯著差異表達。GO和KEGG分析顯示靶基因主要參與內(nèi)吞作用、代謝途徑、FoxO、Hippo、Jak-STAT和MAPK等信號通路,表明miRNA在BTV感染媒介細胞過程中發(fā)揮廣泛的調(diào)控作用。2.選取具有差異表達的aae-miR-1889-5p和aae-miR-2940-5p為靶標,將其模擬體、抑制劑及對照轉(zhuǎn)染A.albopictus細胞,并利用qRT-PCR和噬斑試驗分析BTV在轉(zhuǎn)染細胞中的增殖效率,結果表明兩種miRNA模擬體可分別上調(diào)BTV NS3基因表達1.55-2.88倍和2.00-3.22倍,且病毒滴度均增加,而miRNA抑制劑可明顯分別下調(diào)BTV NS3基因的表達0.54-0.64倍和0.55-0.86倍,且病毒滴度均降低,表明aae-miR-1889-5p和aae-miR-2940-5p均可促進BTV在A.albopictus細胞中復制。3.BTV感染PST細胞組和對照組經(jīng)高通量測序獲得10,908,164和11,920,794個可信序列標簽,分別含87和90個已知miRNA,182和155個新預測miRNA。兩組之間有2個已知miRNA和70個新miRNA發(fā)生顯著的差異表達。GO功能和KEGG路徑分析顯示差異表達miRNA的靶基因主要參與催化活性、病毒感染、內(nèi)吞作用、代謝途徑等信號通路,表明miRNA在BTV感染宿主細胞的多個環(huán)節(jié)同樣具有潛在的調(diào)控作用。4.進而選取novel-mir-105為靶標,將其模擬體、抑制劑及對照轉(zhuǎn)染PST細胞,并利用qRT-PCR和噬斑試驗分析BTV在轉(zhuǎn)染細胞中的增殖效率,結果表明miRNA模擬體轉(zhuǎn)染組BTV NS3基因下調(diào)0.32-0.80倍,且病毒滴度降低,而miRNA抑制劑轉(zhuǎn)染組BTV NS3基因上調(diào)2.09-2.41倍,且病毒滴度增加,表明novel-mir-105抑制BTV在PST細胞中復制。
【關鍵詞】：藍舌病病毒 白紋伊蚊細胞 原代綿羊睪丸細胞 高通量測序 miRNA
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S855.3
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-14
• 第一章 引言14-23
• 1.1 藍舌病概況14-15
• 1.2 藍舌病毒15-18
• 1.2.1 藍舌病毒形態(tài)和基因組結構15-18
• 1.2.2 藍舌病毒復制周期18
• 1.3 microRNA概述18-21
• 1.3.1 miRNA生物起源18-20
• 1.3.2 miRNA作用機制20
• 1.3.3 miRNA研究方法-高通量測序技術20-21
• 1.4 細胞miRNA與病原相互作用的研究21-22
• 1.5 研究目的與意義22-23
• 第二章 藍舌病毒感染A. albopictus細胞miRNA表達譜的鑒定23-44
• 2.1 實驗材料23-24
• 2.1.1 細胞與病毒23
• 2.1.2 主要實驗試劑23
• 2.1.3 主要儀器設備23-24
• 2.2 實驗方法24-31
• 2.2.1 細胞培養(yǎng)24
• 2.2.2 BTV感染A.albopictus細胞的收集和總RNA提取24-25
• 2.2.3 RT-PCR和噬斑試驗25-26
• 2.2.4 高通量測序26-27
• 2.2.5 測序數(shù)據(jù)分析27-28
• 2.2.6 miRNA分析28
• 2.2.7 miRNA靶基因預測28
• 2.2.8 實時定量PCR驗證miRNA及其靶基因28-31
• 2.2.9 miRNA靶基因的GO和KEGG分析31
• 2.3 結果31-43
• 2.3.1 BTV在A.albopictus細胞中的增殖特性31-33
• 2.3.2 測序數(shù)據(jù)分析33-34
• 2.3.3 已知miRNA的鑒定和差異表達分析34-36
• 2.3.4 新miRNA的預測和差異表達分析36-40
• 2.3.5 miRNA靶基因的GO及KEGG分析40-41
• 2.3.6 實時定量PCR驗證miRNA及其對應靶基因41-43
• 2.4 討論43-44
• 第三章 藍舌病毒感染PST細胞miRNA表達譜的鑒定44-58
• 3.1 實驗材料44
• 3.1.1 細胞、病毒和抗體44
• 3.1.2 主要實驗試劑與儀器設備44
• 3.2 實驗方法44-47
• 3.2.1 PST細胞的制備與培養(yǎng)44-45
• 3.2.2 細胞免疫熒光試驗45
• 3.2.3 BTV感染PST細胞的收集和RNA提取45
• 3.2.4 RT-PCR和噬斑試驗45
• 3.2.5 測序樣品收集45-46
• 3.2.6 高通量測序46
• 3.2.7 生物信息學分析46
• 3.2.8 新miRNA和對應靶基因的預測46
• 3.2.9 miRNA差異分析46
• 3.2.10 GO功能和KEGG路徑分析46-47
• 3.2.11 實時定量PCR驗證mi RNA47
• 3.3 結果47-56
• 3.3.1 BTV在PST細胞中的生長增殖特性47-49
• 3.3.2 測序數(shù)據(jù)分析49-51
• 3.3.3 顯著差異表達miRNA分析51-55
• 3.3.4 miRNA靶基因分析55
• 3.3.5 GO功能和KEGG路徑分析55-56
• 3.3.6 實時定量PCR驗證顯著差異表達miRNA56
• 3.4 討論56-58
• 第四章 藍舌病毒感染細胞后3個細胞miRNA功能初步研究58-71
• 4.1 實驗材料58
• 4.1.1 細胞與病毒58
• 4.1.2 主要實驗試劑58
• 4.2 實驗方法58-62
• 4.2.1 miRNA模擬體和抑制劑的設計與合成58-59
• 4.2.2 siRNA的設計與合成59-60
• 4.2.3 PST細胞轉(zhuǎn)染miRNA最佳條件摸索60
• 4.2.4 A.albopictus細胞轉(zhuǎn)染miRNA和siRNA最佳條件摸索60
• 4.2.5 轉(zhuǎn)染實驗60-61
• 4.2.6 轉(zhuǎn)染樣品收集及RNA提取61
• 4.2.7 實時定量PCR和噬斑試驗驗證miRNA和靶標基因?qū)TV復制的調(diào)節(jié)作用61-62
• 4.3 結果62-69
• 4.3.1 miRNA和siRNA轉(zhuǎn)染實驗最佳條件的確定62-64
• 4.3.2 Novel-mir-105抑制BTV在PST細胞中復制64-65
• 4.3.3 Aae-miR18895p和aae-miR29405p均促進BTV在A.albopictus細胞中復制65-68
• 4.3.4 靶標基因AAEL012723和AAEL018190表達量下調(diào)抑制BTV在A.albopictus細胞中復制68-69
• 4.4 討論69-71
• 第五章 全文結論71-72
• 參考文獻72-79
• 致謝79-80
• 作者簡歷80

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本文編號：849052