本文關(guān)鍵詞：豬瘟病毒蛋白對(duì)其3’UTR的調(diào)節(jié)作用

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【摘要】：豬瘟(Classical swine fever)是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引發(fā)的一種疾病,具有高致病性和高傳染性,可對(duì)豬類養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列為A類疾病。豬瘟病毒是一種單股正鏈RNA病毒,其基因組包括一個(gè)開放閱讀框(open reading frame,ORF),一個(gè)3’端非編碼區(qū)(3’untranslated region,3’UTR)和一個(gè)5’端非編碼區(qū)(5’untranslated region,5’UTR)。豬瘟病毒的開放閱讀框編碼一個(gè)由3898個(gè)氨基酸所組成的多聚蛋白,該多聚蛋白可在病毒自身蛋白酶和宿主細(xì)胞信號(hào)肽酶的水解和修飾作用下形成12個(gè)成熟的蛋白,包括C、Erns、E1、E2、Npro、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B。豬瘟病毒基因組的復(fù)制過(guò)程需要多種自身非結(jié)構(gòu)蛋白的參與,研究表明NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B是豬瘟病毒RNA復(fù)制所必需的。豬瘟病毒3’UTR的二級(jí)結(jié)構(gòu)包括4或5個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)(stem loop,SL),對(duì)病毒RNA的復(fù)制和翻譯有著重要作用。為了研究豬瘟病毒各個(gè)蛋白對(duì)其3’UTR在翻譯水平的調(diào)節(jié)作用,本研究構(gòu)建了豬瘟病毒各蛋白的真核表達(dá)載體和3’UTR的熒光素酶表達(dá)載體,并將各蛋白的真核表達(dá)載體分別與3’UTR的熒光素酶表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染至PK-15細(xì)胞,利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)分析各蛋白對(duì)3’UTR的功能是否具有調(diào)節(jié)作用。結(jié)果顯示豬瘟病毒C、NS4A、NS5A和NS5B蛋白對(duì)其3’UTR的功能具有顯著的調(diào)節(jié)作用。其中C蛋白和NS5B蛋白可以顯著降低3’UTR的翻譯抑制功能,因此推測(cè)C蛋白和NS5B蛋白對(duì)病毒的翻譯起到促進(jìn)作用;而NS4A、NS5A蛋白可以促進(jìn)3’UTR的翻譯抑制功能,推測(cè)對(duì)病毒的翻譯起到抑制作用。為了進(jìn)一步研究豬瘟病毒C蛋白對(duì)其3’UTR在翻譯水平的調(diào)節(jié)作用,首先研究C蛋白在3’UTR上的具體調(diào)節(jié)位點(diǎn)。通過(guò)構(gòu)建3’UTR不同莖環(huán)區(qū)域調(diào)控下的熒光素酶表達(dá)載體,并與C蛋白的真核表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染后,發(fā)現(xiàn)C蛋白對(duì)其3’UTR的調(diào)節(jié)位點(diǎn)主要定位于3’UTR的1-139nt區(qū)(SL-1和SL-2)。同時(shí)也研究了豬瘟病毒C蛋白對(duì)3’UTR發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的主要功能區(qū)域。利用生物信息學(xué)對(duì)C蛋白進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)59-69位氨基酸為C蛋白的氨基酸保守區(qū),對(duì)該區(qū)域進(jìn)行缺失突變后,利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)分析,結(jié)果顯示豬瘟病毒C蛋白的59-69位氨基酸對(duì)于C蛋白在3’UTR的調(diào)節(jié)過(guò)程中起到較為重要的作用�？傊�,本研究利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)豬瘟病毒C蛋白對(duì)其3’UTR在翻譯水平的功能具有顯著的抑制作用,推測(cè)對(duì)病毒的翻譯可起到促進(jìn)作用,且該調(diào)節(jié)作用主要定位于3’UTR的1-139nt(SL-1和SL-2)區(qū)域;C蛋白中的第59-69位氨基酸在此調(diào)節(jié)作用中發(fā)揮了較為重要的作用。
【關(guān)鍵詞】：豬瘟 豬瘟病毒 3’端非編碼區(qū) C蛋白
【學(xué)位授予單位】：山東師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.651
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 第一部分 背景介紹10-16
• 1 豬瘟（Classical swine fever）10
• 2 豬瘟病毒10-13
• 3 豬瘟病毒C蛋白的主要功能13-15
• 4 研究目的和意義15-16
• 第二部分 豬瘟病毒蛋白真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其表達(dá)檢測(cè)16-48
• 1 材料16-23
• 1.1 載體、菌株和細(xì)胞系16
• 1.2 主要試劑16-17
• 1.3 溶液配制17-22
• 1.4 主要儀器設(shè)備22-23
• 2 方法23-41
• 2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成23-24
• 2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與提取24-37
• 2.3 細(xì)胞的復(fù)蘇與培養(yǎng)37-38
• 2.4 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染38-39
• 2.5 Western Blot39-41
• 3 結(jié)果41-47
• 3.1 豬瘟病毒蛋白真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定41-46
• 3.2 豬瘟病毒蛋白的真核表達(dá)與檢測(cè)46-47
• 4 結(jié)論47-48
• 第三部分 豬瘟病毒蛋白對(duì)其 3’UTR功能發(fā)揮的影響48-53
• 1 材料48
• 1.1 載體、質(zhì)粒和細(xì)胞系48
• 1.2 主要試劑48
• 1.3 主要儀器設(shè)備48
• 2 方法48-49
• 2.1 細(xì)胞的復(fù)蘇與培養(yǎng)48
• 2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48-49
• 2.3 雙熒光素酶相對(duì)活性的檢測(cè)49
• 3 結(jié)果49-51
• 3.1 豬瘟病毒結(jié)構(gòu)蛋白對(duì)其 3’UTR功能發(fā)揮的影響49-50
• 3.2 豬瘟病毒非結(jié)構(gòu)蛋白對(duì)其 3’UTR功能發(fā)揮的影響50-51
• 4 討論51-53
• 第四部分 豬瘟病毒C蛋白對(duì)其 3’UTR功能發(fā)揮的影響53-64
• 1 材料53
• 2 方法53-56
• 2.1 豬瘟病毒 3’UTR及C蛋白的結(jié)構(gòu)及功能分析53-54
• 2.2 引物的設(shè)計(jì)與合成54
• 2.3 pCMV-C- deletion和pMIR105157重組質(zhì)粒的構(gòu)建與提取54-55
• 2.4 細(xì)胞的復(fù)蘇與培養(yǎng)55-56
• 2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染56
• 2.6 western blot56
• 2.7 雙熒光素酶活性檢測(cè)56
• 3 結(jié)果56-62
• 3.1 豬瘟病毒 3’UTR SL-3 區(qū)域熒光素酶表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定56-57
• 3.2 豬瘟病毒C蛋白突變載體的構(gòu)建、表達(dá)與檢測(cè)57
• 3.3 豬瘟病毒C蛋白對(duì)其 3’UTR功能的影響57-62
• 4 討論62-64
• 參考文獻(xiàn)64-68
• 附錄68-75
• 致謝75

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本文編號(hào)：841237