本文關(guān)鍵詞：狂犬病病毒樣顆粒免疫原的制備與實驗免疫研究

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【摘要】：狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)引起的侵害中樞神經(jīng)系統(tǒng)的致死性人獸共患傳染病,發(fā)病后幾乎100%死亡,至今仍無特效治療藥物。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計,全世界每年至少六萬人死于狂犬病,大多數(shù)的病例發(fā)生于非洲和亞洲�？袢≈饕ㄟ^被患狂犬病的病犬抓、咬傷所傳播,因此從源頭上控制動物的狂犬病是消滅人狂犬病的根本。對家養(yǎng)犬、貓和野生動物等進行有效的狂犬病疫苗免疫降低其感染幾率,是控制動物狂犬病的最主要舉措。病毒樣顆粒(Virus-like particles,VLPs)為不含核酸的病毒空殼結(jié)構(gòu),由病毒衣殼蛋白或者由衣殼蛋白和囊膜蛋白在體外自主裝配組成的一種顆粒。VLPs保留了天然病毒的形態(tài)和結(jié)構(gòu),同時還可以模擬天然病毒對宿主的感染,可刺激機體同時產(chǎn)生細胞免疫和體液免疫。此外,由于VLPs不含有核酸,無感染和復制能力。VLPs作為免疫原制備新型疫苗已顯示出免疫原性強和安全性好等優(yōu)點,是具有良好前景和應(yīng)用開發(fā)潛力的候選疫苗。RABV糖蛋白(Glycoprotein,GP)為唯一誘導并刺激機體產(chǎn)生病毒中和抗體的結(jié)構(gòu)蛋白,基質(zhì)蛋白(Matrix protein,MP)是維持病毒形態(tài)的結(jié)構(gòu)蛋白,還決定了RABV的合成、出芽,且MP上具有GP專一性結(jié)合位點,同時也會對GP在病毒包膜表面的結(jié)構(gòu)形態(tài)造成影響。鞭毛蛋白(flagellin)是Toll樣受體5(toll-like receptor,TLR5)天然激動劑,可刺激B細胞和T細胞參與適應(yīng)性免疫,誘導高效的天然免疫。大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞基(LTB)與神經(jīng)節(jié)苷脂GM1高度親和,增強抗原提呈能力,誘導淋巴細胞增殖與分化,提高機體免疫應(yīng)答。GP和MP是構(gòu)建RABV-VLP的基本組成蛋白,flagellin和LTB則可作為狂犬病病毒VLP膜錨定形式的分子佐劑。本研究將構(gòu)建的分別表達狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白和Flagellin、LTB等因子的重組桿狀病毒共同感染昆蟲細胞,制備了兩種嵌合型狂犬病VLPs,同時對其免疫原性進行了評價。此外,本研究還建立了可特異性檢測狂犬病病毒糖蛋白含量的雙抗體夾心ELISA檢測方法。第一章:雙抗體夾心ELISA定量檢測狂犬病病毒糖蛋白檢測方法的建立及初步應(yīng)用。以狂犬病病毒糖蛋白單克隆抗體作為捕獲抗體,犬抗狂犬病病毒多克隆抗體作為檢測抗體,以半數(shù)細胞感染量(TCID50)準確定量的狂犬病病毒SRV9毒株病毒液為標準品,建立了檢測狂犬病病毒糖蛋白(RABV-GP)含量的雙抗體夾心ELISA定量檢測方法,通過優(yōu)化反應(yīng)條件后,對其特異性、重復性和靈敏度進行分析。結(jié)果顯示,雙抗體夾心ELISA定量檢測方法最佳工作條件為:狂犬病病毒糖蛋白蛋白單克隆抗體包被濃度為2.5μg/mL,100μL/孔,4℃包被過夜;1%BSA,37℃封閉120min;犬抗狂犬病病毒多克隆抗體1:200稀釋,37℃孵育90min;酶標二抗1:5000稀釋,37℃孵育60min;TMB室溫避光顯色30min。該方法可特異性定量檢測狂犬病病毒,與犬細小病毒、犬瘟熱病毒和犬傳染性肝炎病毒均不發(fā)生反應(yīng)。該方法線性檢測范圍為1×104~1.0×107TCID50/mL,平均批內(nèi)變異系數(shù)小于6%,平均批間變異系數(shù)均小于8%。第二章:嵌合型狂犬病病毒病毒樣顆粒免疫原的制備與鑒定。將表達RABV Evelyn-Rokitnicki-Abelseth(ERA)株GP和MP的重組桿狀病毒、含GP跨膜區(qū)和胞質(zhì)尾區(qū)的flagellin和LTB融合基因的重組桿狀病毒進行體外傳代培養(yǎng),并分別將表達GP、MP和flagellin或LTB的三種重組桿狀病毒共感染懸浮培養(yǎng)的Sf9細胞,27℃培養(yǎng)4~5d,離心收集細胞上清液。電鏡觀察可見大小約在180~200 nm、纖突明顯的圓形或橢圓形RABV-VLP,Western Blot結(jié)果表明兩種嵌合型RABV-VLP的四種組成蛋白GP、MP和flagellin或LTB均成功表達。經(jīng)ELISA檢測表明:兩種嵌合型RABV-VLP的糖蛋白含量相當于細胞培養(yǎng)的天然狂犬病病毒糖蛋白含量。數(shù)據(jù)表明:利用懸浮培養(yǎng)昆蟲細胞成功組裝了可同時表達Flagellin或LTB的兩種嵌合型狂犬病病毒病毒樣顆粒EVLP-F和EVLP-L。第三章:嵌合型狂犬病病毒病毒樣顆粒免疫原的實驗免疫研究。分別將表達GP、MP和flagellin或LTB的三種重組桿狀病毒共感染懸浮培養(yǎng)的Sf9細胞,27℃培養(yǎng)4~5d,收獲細胞混合物進行高壓爆破處理后離心收取上清。將收集的細胞上清分別輔以鋁膠、多糖佐劑和弗氏佐劑制備狂犬病病毒樣顆粒疫苗。分別通過肌肉注射方式免疫小鼠和犬,首次免疫間隔兩周后加強免疫一次,對EVLP-F和EVLP-L的免疫效果進行評價。小鼠免疫實驗結(jié)果顯示,首次免疫后兩周,免疫小鼠血清內(nèi)均可檢測到狂犬病病毒中和抗體(Virus neutralization antibody,VNA),且EVLP-L免疫組小鼠VNA滴度高于EVLP-F免疫組,鋁膠佐劑免疫組VNA滴度高于多糖佐劑組和弗氏佐劑組。加強免疫后,免疫小鼠VNA滴度均獲得顯著提高,最高抗體效價可到23.38IU/mL。犬免疫實驗結(jié)果顯示,免疫后一周,免疫犬體內(nèi)即可產(chǎn)生VNA,且EVLP-L免疫組VNA滴度高于EVLP-F免疫組,鋁膠佐劑免疫組VNA滴度高于多糖佐劑組。加強免疫后,免疫犬VNA滴度均獲得顯著提高,最高抗體效價可到53.30IU/mL。數(shù)據(jù)表明:兩種嵌合型RABV-VLP均具有良好的免疫原性,免疫后可刺激機體產(chǎn)生高滴度的狂犬病病毒中和抗體,具有發(fā)展成為高效、低成本新型狂犬病疫苗的良好前景。
【關(guān)鍵詞】：狂犬病 雙抗體夾心ELISA 狂犬病病毒樣顆粒 免疫原性
【學位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.4
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 前言10-11
• 第一篇 文獻綜述11-16
• 1.1 狂犬病概述11-13
• 1.2 病毒樣顆粒研究進展13-14
• 1.3 鞭毛蛋白及大腸桿菌不耐熱腸毒素的佐劑效應(yīng)研究進展14-15
• 1.4 狂犬病病毒定量檢測方法概述15-16
• 第二篇 研究內(nèi)容16-46
• 第一章 狂犬病病毒糖蛋白雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立及初步應(yīng)用16-26
• 1.1 材料16-18
• 1.2 方法18-21
• 1.3 結(jié)果21-24
• 1.4 討論24-25
• 1.5 小結(jié)25-26
• 第二章 嵌合狂犬病病毒樣顆粒的制備與鑒定26-37
• 2.1 材料26-28
• 2.2 方法28-32
• 2.3 結(jié)果32-35
• 2.4 討論35-36
• 2.5 小結(jié)36-37
• 第三章 嵌合狂犬病病毒樣顆粒實驗免疫研究37-46
• 3.1 材料37-38
• 3.2 方法38-41
• 3.3 結(jié)果41-44
• 3.4 討論44
• 3.5 小結(jié)44-46
• 結(jié)論46-47
• 參考文獻47-52
• 附錄52-54
• 作者簡介54-55
• 致謝55-56

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本文編號：838978