本文關(guān)鍵詞：ANK1基因在弓形蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育中的作用研究

  更多相關(guān)文章： 弓形蟲(chóng) ANK1 CRISPR/Cas9 RNA-seq 緩殖子發(fā)育

【摘要】：弓形蟲(chóng)是一種宿主范圍廣泛的人畜共患寄生蟲(chóng),可感染包括人在內(nèi)的所有溫血?jiǎng)游?全世界約有四分之一的人口感染弓形蟲(chóng)病。免疫力正常的宿主感染弓形蟲(chóng)后,在宿主免疫壓力的作用下,弓形蟲(chóng)會(huì)在宿主體內(nèi)轉(zhuǎn)變成緩殖子,以組織包囊形式存在,造成機(jī)體的終生慢性感染。當(dāng)機(jī)體的免疫力下降時(shí),包囊內(nèi)的緩殖子會(huì)再活化,形成速殖子,造成宿主急性感染。弓形蟲(chóng)速殖子與緩殖子相互轉(zhuǎn)化在弓形蟲(chóng)病傳播與發(fā)病中起到重要作用。在弓形蟲(chóng)速殖子與緩殖子相互轉(zhuǎn)化過(guò)程中,約有400個(gè)基因的表達(dá)會(huì)發(fā)生明顯變化,但是這些基因在緩殖子形成中的作用仍不清楚,而鑒定它們?cè)诰徶匙有纬芍械淖饔每梢詾槔斫饩徶匙影l(fā)育的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ),,為弓形蟲(chóng)疫苗設(shè)計(jì)提供理論依據(jù)。本研究選取一個(gè)含有三十四肽重復(fù)結(jié)構(gòu)域的緩殖子期上調(diào)基因ANK1,利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)將ANK1基因在PRU株中敲除,獲得了ANK1基因缺失株,通過(guò)比較敲除株與野生株生長(zhǎng)、復(fù)制和毒力的差異,發(fā)現(xiàn)與野生株相比,敲除株在生長(zhǎng)、復(fù)制和毒力方面均有缺陷。具體工作包括以下幾個(gè)方面:(1)ANK1蛋白N-端及全長(zhǎng)的原核表達(dá)構(gòu)建pE-SUMO-ANK1-Nter和pE-SUMO-ANK1原核表達(dá)質(zhì)粒,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中并進(jìn)行原核表達(dá)。在37℃誘導(dǎo)條件下,ANK1蛋白N端和全長(zhǎng)均能得到高效表達(dá),但ANK1蛋白全長(zhǎng)主要以包涵體的形式存在。優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件發(fā)現(xiàn),當(dāng)大腸桿菌OD600值達(dá)1.5時(shí),16℃用終濃度為0.1mM的IPTG誘導(dǎo)可提高蛋白在上清中的表達(dá)量。(2)ANK1敲除株的構(gòu)建利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)ANK1基因進(jìn)行敲除。首先,構(gòu)建ANK1基因特異性CRISPR質(zhì)粒pSAG1-Cas9-U6-ANK1和同源模板質(zhì)粒pANK1-DHFR,然后將同源模板片段和pSAG1-Cas9-U6-ANK1質(zhì)粒共電轉(zhuǎn)到PRU速殖子中,用乙胺嘧啶進(jìn)行篩選并用限制稀釋法在96孔板中獲取單克隆,經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后用PCR進(jìn)行鑒定,結(jié)果顯示成功獲得ANK1敲除株。(3)ANK1敲除株表型研究通過(guò)空斑實(shí)驗(yàn)比較敲除株和野生株生長(zhǎng)的差異,發(fā)現(xiàn)敲除株的生長(zhǎng)明顯比野生株慢;通過(guò)復(fù)制實(shí)驗(yàn)比較野生株和敲除株在蟲(chóng)體復(fù)制方面的差異,發(fā)現(xiàn)與野生株相比敲除株在復(fù)制方面有明顯的缺陷;通過(guò)小鼠毒力實(shí)驗(yàn)比較野生株和敲除株對(duì)小鼠的毒力情況,發(fā)現(xiàn)與野生株相比,敲除株的毒力明顯下降。小鼠保護(hù)力實(shí)驗(yàn)顯示,經(jīng)ANK1敲除株免疫的小鼠對(duì)致死劑量的野生型蟲(chóng)株有很好的抗性,證明了敲除株的免疫保護(hù)性為100%。(4)RNA-seq尋找野生株與敲除株的基因表達(dá)差異體外培養(yǎng)敲除株和野生株獲得速殖子,體外堿性誘導(dǎo)敲除株和野生株形成緩殖子,提取速殖子和緩殖子RNA,利用RNA-seq尋找野生株與敲除株表達(dá)量有差異的基因。本研究中,共找到430個(gè)緩殖子期敲除株和野生株表達(dá)量有差異的基因;510個(gè)速殖子期敲除株和野生株表達(dá)有差異的基因。本研究利用CRISPR/Cas技術(shù)將ANK1基因在PRU中進(jìn)行敲除,成功獲得單克隆敲除株。與野生株P(guān)RU比較發(fā)現(xiàn),敲除株在生長(zhǎng)、復(fù)制和小鼠毒力方面有明顯的缺陷,并且敲除株對(duì)小鼠具有很好的保護(hù)力,有成為基因工程疫苗的潛力。通過(guò)RNA-seq發(fā)現(xiàn)敲除株和野生株在緩殖子期有430個(gè)基因的表達(dá)量有明顯差異,而在速殖子期有510個(gè)基因的表達(dá)量有明顯差異,為進(jìn)一步研究ANK1影響弓形蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：弓形蟲(chóng) ANK1 CRISPR/Cas9 RNA-seq 緩殖子發(fā)育
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S852.7
【目錄】：

• 摘要7-9
• Abstract9-11
• 縮略語(yǔ)表11-12
• 1．文獻(xiàn)綜述12-21
• 1.1 弓形蟲(chóng)綜述12-14
• 1.1.1 弓形蟲(chóng)與弓形蟲(chóng)病12
• 1.1.2 弓形蟲(chóng)生活史12-13
• 1.1.3 弓形蟲(chóng)病治療與疫苗13-14
• 1.2 弓形蟲(chóng)緩殖子分化發(fā)育研究進(jìn)展14-18
• 1.2.1 弓形蟲(chóng)緩殖子形成14-15
• 1.2.2 宿主細(xì)胞對(duì)弓形蟲(chóng)緩殖子發(fā)育的影響15
• 1.2.3 弓形蟲(chóng)自身調(diào)控機(jī)制對(duì)緩殖子分化發(fā)育的影響15-18
• 1.3 三十四肽重復(fù)結(jié)構(gòu)域研究進(jìn)展18-19
• 1.4 CRISPR/CAS9系統(tǒng)研究進(jìn)展19-21
• 2．研究目的與意義21-22
• 3．材料與方法22-36
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料22-23
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物22
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)菌株、蟲(chóng)株與細(xì)胞22
• 3.1.3 載體與質(zhì)粒22
• 3.1.4 引物22-23
• 3.2 主要儀器與試劑23-25
• 3.2.1 主要儀器23
• 3.2.2 主要試劑盒23
• 3.2.3 主要試劑23-24
• 3.2.4 主要溶液的配制24-25
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法25-36
• 3.3.1 弓形蟲(chóng)的體外培養(yǎng)25
• 3.3.2 弓形蟲(chóng)基因組DNA的提取25-26
• 3.3.3 弓形蟲(chóng)RNA的提取26
• 3.3.4 弓形蟲(chóng)cDNA的制備26-27
• 3.3.5 基因敲除相關(guān)質(zhì)粒的構(gòu)建27-29
• 3.3.6 重組蛋白的原核表達(dá)29
• 3.3.7 His融合蛋白的鎳柱純化29-30
• 3.3.8 純化蛋白的透析與保存30
• 3.3.9 BCA法蛋白質(zhì)濃度測(cè)定30-31
• 3.3.10 ANK1敲除株的構(gòu)建及鑒定31-33
• 3.3.11 空斑實(shí)驗(yàn)33
• 3.3.12 復(fù)制實(shí)驗(yàn)33
• 3.3.13 弓形蟲(chóng)蟲(chóng)株毒力實(shí)驗(yàn)33-34
• 3.3.14 弓形蟲(chóng)腦包囊計(jì)數(shù)34
• 3.3.15 敲除株對(duì)小鼠保護(hù)力實(shí)驗(yàn)34
• 3.3.16 體外誘導(dǎo)弓形蟲(chóng)緩殖子形成34-35
• 3.3.17 RNA-seq檢測(cè)敲除株與野生株基因表達(dá)差異35-36
• 4．結(jié)果與分析36-55
• 4.1 弓形蟲(chóng)ANK1蛋白N-端及全長(zhǎng)原核表達(dá)、蛋白純化36-41
• 4.1.1 ANK1基因N-端及全長(zhǎng)片段擴(kuò)增36
• 4.1.2 ANK1基因N-端及全長(zhǎng)表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建36-37
• 4.1.3 ANK1蛋白N-端及全長(zhǎng)原核表達(dá)37-39
• 4.1.4 ANK1蛋白全長(zhǎng)表達(dá)條件的優(yōu)化39
• 4.1.5 ANK1蛋白N-端及全長(zhǎng)蛋白純化39-41
• 4.2 ANK1敲除質(zhì)粒的構(gòu)建41-45
• 4.2.1.pANK1-DHFR質(zhì)粒的構(gòu)建41-43
• 4.2.2 ANK1敲除株的構(gòu)建43-44
• 4.2.3 ANK1敲除株鑒定44-45
• 4.3 ANK1敲除株表型研究45-50
• 4.3.1 空斑實(shí)驗(yàn)45
• 4.3.2 復(fù)制實(shí)驗(yàn)45-46
• 4.3.3 毒力實(shí)驗(yàn)46-47
• 4.3.4 小鼠腦包囊形成實(shí)驗(yàn)47-48
• 4.3.5 不同劑量敲除株對(duì)小鼠毒力48-49
• 4.3.6 小鼠保護(hù)力實(shí)驗(yàn)49-50
• 4.4 RNA-seq檢測(cè)ANK1敲除株與野生株基因表達(dá)差異50-55
• 4.4.1 野生株和敲除株速殖子與緩殖子RNA樣本的制備50-51
• 4.4.2 RNA-seq檢測(cè)敲除株與野生株基因表達(dá)量差異51-55
• 5．討論55-59
• 5.1 弓形蟲(chóng)ANK1蛋白N-端及全長(zhǎng)的原核表達(dá)55
• 5.2 弓形蟲(chóng)ANK1基因敲除株的構(gòu)建及表型研究55-57
• 5.3 RNA-seq檢測(cè)敲除株與野生株基因差異性表達(dá)57-59
• 6．結(jié)論59
• 7．展望59-60
• 參考文獻(xiàn)60-67
• 致謝67-68

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 李學(xué)瑞;趙象忠;王艷華;張德林;;弓形蟲(chóng)速殖子與弓形蟲(chóng)緩殖子相互轉(zhuǎn)換的研究進(jìn)展[J];畜牧與獸醫(yī);2006年02期

2 ;[J];;年期

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 姚云英;對(duì)比研究Prugniaud株弓形蟲(chóng)速殖子和緩殖子中microRNA的表達(dá)[D];南方醫(yī)科大學(xué);2013年

2 張加勤;弓形蟲(chóng)LDH2基因啟動(dòng)子的克隆及初步鑒定[D];山東大學(xué);2008年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前7條

1 刁慧艷;ANK1基因在弓形蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育中的作用研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

2 施遠(yuǎn)香;弓形蟲(chóng)速殖子與緩殖子體外相互轉(zhuǎn)換模型的構(gòu)建[D];中南大學(xué);2014年

3 袁園;運(yùn)輸應(yīng)激條件下弓形蟲(chóng)緩殖子向速殖子轉(zhuǎn)化差異蛋白的篩選及鑒定[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

4 王瓊;弓形蟲(chóng)緩殖子期特異性抗原的基因克隆、蛋白表達(dá)及重組BAG1抗原的初步應(yīng)用[D];南方醫(yī)科大學(xué);2007年

5 程健曦;IFN-γ抑制弓形蟲(chóng)緩殖子向速殖子轉(zhuǎn)化的研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

6 丁潔瓊;弓形蟲(chóng)速殖子與緩殖子體外轉(zhuǎn)化體系的建立及BAG1基因在轉(zhuǎn)化中作用的初步研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2010年

7 張敏;弓形蟲(chóng)緩殖子抗原SAG2C/2D/2X核酸疫苗及優(yōu)勢(shì)表位抗弓形蟲(chóng)慢性感染的實(shí)驗(yàn)研究[D];山東大學(xué);2014年

，

本文編號(hào)：829268