本文關(guān)鍵詞：抗雞傳染性法氏囊病病毒抗體ELISA檢測方法的建立及標(biāo)準(zhǔn)抗原、標(biāo)準(zhǔn)血清的研制

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【摘要】：傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是由傳染性法氏囊病毒(IBDV)感染引起的一種急性、高度接觸性傳染病。該病主要侵害3-6周齡雛雞及青年雞,使雞群發(fā)病、死亡,同時病毒侵害雞法氏囊B淋巴細(xì)胞,導(dǎo)致機(jī)體免疫抑制,誘發(fā)雞群疫苗免疫失敗,并對其他疾病的易感性增加,出現(xiàn)繼發(fā)感染或混合感染。因此,傳染性法氏囊病被認(rèn)為是目前嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)的重要傳染病之一。本研究利用分子生物學(xué)技術(shù)成功獲得了GST-VP2和GST-VP3的可溶性重組蛋白,并以此表達(dá)產(chǎn)物建立了檢測IBDV抗體的ELISA方法；同時,應(yīng)用IBDV-JS株感染SPF雞,制備了IBDV抗原和陽性血清,并對抗原和抗體進(jìn)行了一系列的鑒定和標(biāo)定,獲得了相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)抗原和標(biāo)準(zhǔn)血清,為IBDV的診斷提供了有效的方法和材料。1.檢測IBDV抗體ELISA方法的建立本研究根據(jù)IBDV-JS株的序列,分別設(shè)計了VP2和VP3基因的特異性引物,通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法對VP2和VP3基因的全長進(jìn)行了擴(kuò)增,然后將目的片段經(jīng)雙酶切克隆至表達(dá)載體pGEX-6p-1,并轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)菌,挑取陽性細(xì)菌克隆送公司測序鑒定。測序正確的pGEX-6p-1-VP2和pGEX-6p-1-VP3經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后,十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物,結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)IPTG終濃度分別為0.75mM和0.25mM時,細(xì)菌裂解上清中GST-VP2(約80KDa)和GST-VP3(約52KDa)的表達(dá)量最高。蛋白免疫印跡試驗(Western-Blot)結(jié)果顯示GST-VP2和GST-VP3重組蛋白均與IBDV陽性血清反應(yīng),表明重組蛋白具有良好的抗原性。將純化后的重組蛋白GST-VP2和GST-VP3分別作為包被抗原,建立檢測IBDV抗體的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)方法。通過實驗條件的優(yōu)化,確定VP2, VP3抗原最佳包被量分別為5μg/ml,0.625μg/ml,待檢血清最佳稀釋度為1：400,最佳孵育時間為30 min,酶標(biāo)二抗最佳孵育時間為30min,底物最佳顯色時間為15min。用建立的ELISA方法檢測50份SPF雞陰性血清,以確定陽性臨界值：對基于VP2重組融合蛋白建立的ELISA方法,當(dāng)OD6500.12時,判為陽性；對基于VP3重組融合蛋白建立的ELISA方法,當(dāng)OD6500.136時,判為陽性。交叉反應(yīng)性實驗證明本研究建立的抗體ELISA檢測方法僅與IBDV陽性血清反應(yīng),與IBV、ILTV、MDV、ALV、EDSV、AIV-H9、NDV、REV、GPV等陽性血清均不反應(yīng),特異性良好。該方法的批內(nèi)和批間的變異系數(shù)均小于10%,說明該方法可行、重復(fù)性好。用已建立的2種IBDV抗體檢測ELISA方法檢測采集自江蘇地區(qū)的77份雞血清樣品,并與IDEXX公司以及BioChek公司的IBDV抗體檢測試劑盒檢測進(jìn)行比較。結(jié)果VP2蛋白建立的ELISA與兩種商品化試劑盒的檢測符合率分別達(dá)到94.8%和96.1%；VP3蛋白建立的ELISA與兩種商品化試劑盒的檢測符合率僅為58.44%和59.7%。比較結(jié)果表明,用VP2蛋白建立的ELISA方法更適用于臨床樣本的檢測。2.雞傳染性法氏囊病病毒標(biāo)準(zhǔn)抗原、標(biāo)準(zhǔn)血清的研制本研究使用IBDV-JS株經(jīng)泄殖腔、點眼感染28日齡SPF雞,無菌取病死雞法氏囊組織進(jìn)行研磨,通過離心和葡聚糖凝膠層析進(jìn)行病毒純化,對純化的病毒抗原含量進(jìn)行了標(biāo)定。純化后的病毒進(jìn)行PCR鑒定、純粹性鑒定、瓊擴(kuò)效價測定以及Western-blot分析,結(jié)果顯示純化后的IBDV不含IBV、ALV、REV、GPV、MDV、ILTV、AIV、NDV、EDSV等外源性病毒；瓊擴(kuò)效價為1：16；Western-blot試驗結(jié)果顯示純化的病毒能與抗VP2蛋白的單抗反應(yīng)。純化的病毒經(jīng)滅活后,分裝凍干,檢查凍干品物理性狀,計算裝量差異系數(shù)(CV),并進(jìn)行支原體檢驗、無菌檢驗、滅活前后以及凍干前后瓊擴(kuò)效價、穩(wěn)定性、均一性以及長期保存等一系列特性的標(biāo)定,最終研制出雞傳染性法氏囊病標(biāo)準(zhǔn)陽性抗原。以低劑量IBDV-JS株免疫接種14日齡SPF雞,經(jīng)過兩次加強(qiáng)免疫后,再以強(qiáng)毒(經(jīng)泄殖腔、點眼感染)攻擊,攻擊后12天,靜脈試血,效價合格后心臟采血,分離血清,并對血清的特性進(jìn)行測定。瓊擴(kuò)試驗結(jié)果顯示制備的多抗血清效價為1：128；Western-blot試驗結(jié)果顯示制備的多抗血清與IBDV-JS株、IBDV-Q株反應(yīng)時均出現(xiàn)兩條特異性條帶,分子量分別約為30kD和65kD；試驗結(jié)果顯示制備的抗IBDV血清IFA效價為1：1600、ELISA效價為1：51200；免疫熒光試驗(IFA)與血凝抑制試驗(HI)證明該多抗血清與ALV、REV、MDV、EDSV、NDV、IBV、AIV等其他禽源病毒無交叉反應(yīng),特異性良好。對制備的陽性血清進(jìn)行標(biāo)定后,加入萬分之一硫柳汞防腐劑,分裝凍干,檢查凍干品物理性狀,計算裝量差異系數(shù)值(CV),并進(jìn)行支原體檢驗、無菌檢驗、防腐劑添加前后以及凍干前后瓊擴(kuò)效價、穩(wěn)定性、均一性以及長期保存等一系列特性的標(biāo)定,最終研制出雞傳染性法氏囊病標(biāo)準(zhǔn)陽性血清。
【關(guān)鍵詞】：雞傳染性法氏囊病病毒 VP2 VP3 抗原 血清 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S858.31
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-11
• 符號說明11-13
• 文獻(xiàn)綜述 雞傳染性法氏囊病及其診斷技術(shù)的研究現(xiàn)狀13-21
• 1. IBDV概述13-16
• 1.1 病原學(xué)13
• 1.2 血清學(xué)13
• 1.3 分子生物學(xué)13-16
• 1.3.1 IBDV基因組13-14
• 1.3.2 VP1蛋白14
• 1.3.3 VP2蛋白14-15
• 1.3.4 VP3蛋白15
• 1.3.5 VP4蛋白15-16
• 1.3.6 VP5蛋白16
• 2. IBD診斷技術(shù)的研究現(xiàn)狀16-18
• 2.1 免疫學(xué)診斷方法16-17
• 2.1.1 瓊脂擴(kuò)散試驗(AGP)16
• 2.1.2 免疫熒光技術(shù)(FAT)16
• 2.1.3 病毒中和試驗(VNT)16-17
• 2.1.4 酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)17
• 2.2 分子生物學(xué)診斷方法17-18
• 2.2.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)17
• 2.2.2 限制性酶切片段長度多態(tài)性(RFLP)17-18
• 2.2.3 熒光定量PCR(real-time PCR)18
• 2.2.4 環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)18
• 3. IBD診斷與生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)18-21
• 3.1 生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的概念和發(fā)展現(xiàn)狀18-19
• 3.2 獸用生物制品的意義和價值19-20
• 3.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備要求20-21
• 研究一 雞傳染性法氏囊病病毒VP2和VP3蛋白的原核表達(dá)及抗體檢測ELISA方法的建立21-48
• 1. 材料21-22
• 1.1 生物材料21
• 1.2 主要儀器21-22
• 1.3 試劑22
• 2. 方法22-28
• 2.1 引物的設(shè)計和目的片段的擴(kuò)增22-23
• 2.1.1 引物的設(shè)計22
• 2.1.2 病毒基因組的提取和目的片段的擴(kuò)增22-23
• 2.2 VP2與VP3原核表達(dá)載體的構(gòu)建23-25
• 2.2.1 目的片段的回收23
• 2.2.2 表達(dá)載體和目的基因的酶切及回收23-24
• 2.2.3 表達(dá)載體和目的條帶的連接24
• 2.2.4 感受態(tài)細(xì)胞的制備及連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化24-25
• 2.2.5 陽性細(xì)菌克隆的鑒定25
• 2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和鑒定25-26
• 2.3.1 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)25
• 2.3.2 表達(dá)條件的優(yōu)化25
• 2.3.3 SDS-PAGE分析25
• 2.3.4 Western-blot分析25-26
• 2.4 重組蛋白的純化26
• 2.4.1 重組蛋白的大量表達(dá)26
• 2.4.2 重組蛋白的純化26
• 2.5 雞傳染性法氏囊病病毒抗體檢測ELISA方法的建立26-28
• 2.5.1 抗原最佳包被濃度及待檢血清最佳稀釋度的優(yōu)化26-27
• 2.5.2 待檢血清最佳孵育時間的優(yōu)化27
• 2.5.3 酶標(biāo)二抗最佳孵育時間的優(yōu)化27
• 2.5.4 底物最佳顯色時間及終止液的優(yōu)化27
• 2.5.5 抗體檢測ELISA陽性臨界值的確定27
• 2.5.6 ELISA交叉反應(yīng)性的檢驗27
• 2.5.7 ELISA方法的批內(nèi)重復(fù)性和批間重復(fù)性實驗27
• 2.5.8 與商品化試劑盒的檢測結(jié)果比較27-28
• 3. 結(jié)果28-45
• 3.1 IBDV VP2和IBDV VP3目的片段的擴(kuò)增效果28
• 3.2 pGEX-6p-1-VP2和pGEX-6p-1-VP3原核表達(dá)載體的構(gòu)建28-29
• 3.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和鑒定29-32
• 3.3.1 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)29-30
• 3.3.2 表達(dá)條件的優(yōu)化30-32
• 3.4 重組蛋白的純化32-33
• 3.5 雞傳染性法氏囊病病毒抗體檢測ELISA方法的建立33-45
• 3.5.1 抗原最佳包被濃度及待檢血清最佳稀釋度的優(yōu)化33-35
• 3.5.2 待檢血清最佳孵育時間的優(yōu)化35-36
• 3.5.3 酶標(biāo)二抗最佳孵育時間的優(yōu)化36-37
• 3.5.4 底物最佳顯色時間及終止液的優(yōu)化37-39
• 3.5.5 抗體檢測ELISA陽性臨界值的確定39
• 3.5.6 ELISA交叉反應(yīng)性的檢驗39-40
• 3.5.7 ELISA方法的批內(nèi)重復(fù)性和批間重復(fù)性實驗40-44
• 3.5.8 與商品化試劑盒的檢測結(jié)果比較44-45
• 4. 小結(jié)與討論45-48
• 研究二 雞傳染性法氏囊病病毒標(biāo)準(zhǔn)抗原、標(biāo)準(zhǔn)血清的研制48-74
• 1. 材料48-49
• 1.1 生物材料48-49
• 1.2 主要儀器49
• 1.3 試劑49
• 2. 方法49-57
• 2.1 雞傳染性法氏囊病病毒抗原的制備、純化與滅活49-51
• 2.1.1 病毒擴(kuò)增49
• 2.1.2 病毒純化49-50
• 2.1.3 PCR鑒定50
• 2.1.4 病毒滅活條件的優(yōu)化50-51
• 2.2 雞傳染性法氏囊病病毒抗原的特性分析51
• 2.2.1 病毒抗原的純粹性鑒定51
• 2.2.2 瓊擴(kuò)效價測定51
• 2.2.3 Western-blot分析51
• 2.3 雞傳染性法氏囊病病毒標(biāo)準(zhǔn)抗原的標(biāo)定51-52
• 2.3.1 Real-time PCR測定病毒含量51-52
• 2.3.2 滅活前后及凍干前后瓊擴(kuò)效價測定52
• 2.3.3 交叉反應(yīng)性鑒定52
• 2.4 傳染性法氏囊病病毒標(biāo)準(zhǔn)抗原的其他檢驗52-54
• 2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)病毒抗原的分裝52
• 2.4.2 物理性狀的檢查52-53
• 2.4.3 無菌檢驗53
• 2.4.4 支原體檢驗53
• 2.4.5 裝量差異系數(shù)分析53
• 2.4.6 均一性53-54
• 2.4.7 凍融穩(wěn)定性54
• 2.4.8 長期保存54
• 2.5 雞傳染性法氏囊病病毒多抗血清的制備54
• 2.6 雞傳染性法氏囊病病毒標(biāo)準(zhǔn)血清的標(biāo)定54-55
• 2.6.1 瓊擴(kuò)效價測定54
• 2.6.2 交叉反應(yīng)性鑒定54-55
• 2.6.3 Western-blot分析55
• 2.6.4 IFA效價測定55
• 2.6.5 ELISA效價測定55
• 2.7 雞傳染性法氏囊病病毒標(biāo)準(zhǔn)血清其他檢驗55-57
• 2.7.1 標(biāo)準(zhǔn)血清的分裝55-56
• 2.7.2 物理性狀的檢查56
• 2.7.3 無菌檢驗56
• 2.7.4 支原體檢驗56
• 2.7.5 裝量差異系數(shù)分析56-57
• 2.7.6 防腐劑前后及凍干前后效價測定57
• 2.7.7 均一性57
• 2.7.8 凍融穩(wěn)定性57
• 2.7.9 長期保存57
• 3. 結(jié)果57-72
• 3.1 雞傳染性法氏囊病病毒抗原的制備、純化與滅活57-58
• 3.1.1 病毒純化57-58
• 3.1.2 PCR鑒定58
• 3.1.3 病毒滅活條件的優(yōu)化58
• 3.2 雞傳染性法氏囊病病毒抗原的特性分析58-60
• 3.2.1 病毒純粹性鑒定58-59
• 3.2.2 瓊擴(kuò)效價測定59-60
• 3.2.3 Western-blot分析60
• 3.3 雞傳染性法氏囊病病毒標(biāo)準(zhǔn)抗原的標(biāo)定60-62
• 3.3.1 Real-time PCR測定病毒含量60-62
• 3.3.2 滅活前后及凍干前后瓊擴(kuò)效價測定62
• 3.3.3 交叉反應(yīng)性鑒定62
• 3.4 傳染性法氏囊病病毒標(biāo)準(zhǔn)抗原的其他檢驗62-64
• 3.4.1 物理性狀的檢查62
• 3.4.2 無菌檢驗62-63
• 3.4.3 支原體檢驗63
• 3.4.4 裝量差異系數(shù)分析63
• 3.4.5 均一性63-64
• 3.4.6 凍融穩(wěn)定性64
• 3.4.7 長期保存64
• 3.5 雞傳染性法氏囊病病毒標(biāo)準(zhǔn)血清的標(biāo)定64-69
• 3.5.1 瓊擴(kuò)效價測定64-65
• 3.5.2 交叉反應(yīng)性鑒定65-67
• 3.5.3 Western-blot分析67-68
• 3.5.4 IFA效價分析68-69
• 3.5.5 ELISA效價測定69
• 3.6 雞傳染性法氏囊病病毒標(biāo)準(zhǔn)血清的其他檢驗69-72
• 3.6.1 物理性狀的檢查69
• 3.6.2 無菌檢驗69-70
• 3.6.3 支原體檢驗70
• 3.6.4 裝量差異系數(shù)分析70
• 3.6.5 防腐劑添加前后及凍干前后效價測定70
• 3.6.6 均一性70-71
• 3.6.7 凍融穩(wěn)定性71
• 3.6.8 長期保存71-72
• 4. 討論與小結(jié)72-74
• 全文總結(jié)74-75
• 參考文獻(xiàn)75-79
• 致謝79-80

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4 陳倩;抗雞傳染性法氏囊病病毒抗體ELISA檢測方法的建立及標(biāo)準(zhǔn)抗原、標(biāo)準(zhǔn)血清的研制[D];揚(yáng)州大學(xué);2016年

5 劉金萍;強(qiáng)力霉素單克隆抗體的制備及ELISA檢測方法的建立[D];揚(yáng)州大學(xué);2016年

6 劉宏;流行性造血器官壞死病毒ELISA檢測方法的初步建立[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

7 華芳;豬胸膜肺炎放線桿菌單克隆抗體的制備及ELISA檢測方法的建立[D];吉林大學(xué);2007年

8 熊富強(qiáng);兔支氣管敗血波氏桿菌單克隆抗體的制備及雙夾心ELISA檢測方法的建立[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

9 余濤;玉米赤霉烯酮抗獨特型單克隆抗體的制備及無毒ELISA檢測技術(shù)的初步建立[D];暨南大學(xué);2012年

10 楊德全;傳染性支氣管炎病毒核蛋白粘膜免疫及ELISA檢測方法的研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

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本文編號：824801