本文關(guān)鍵詞：貓泛白細胞減少癥病毒反向遺傳學(xué)操作系統(tǒng)的建立

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【摘要】：貓泛白細胞減少癥病毒(Feline panleukopenia virus,FPV,FLPV),又稱貓細小病毒。主要易感動物是貓,故而又稱為貓瘟熱病,也可感染貓以外的多種貓科動物。由于細小病毒顆粒體積極小,最初并沒有學(xué)者報道。隨著電鏡及病毒分離技術(shù)廣泛使用,科研者在傳代細胞和腫瘤組織陸續(xù)分離到細小病毒。法國人Verge首次發(fā)現(xiàn),1939年正式命名,1985年首次在我國自然感染病例中分離到一株貓細小病毒,從而證實貓細小病毒在我國流行。1986年國內(nèi)文獻首次報道云豹、非洲幼獅、華南虎均感染了FPV。由此證明:虎、豹、獅等多種珍稀野生動物已經(jīng)嚴(yán)重受到貓泛白細胞減少癥病毒的威脅。我國某實驗動物基地2008年從猴傳染性腹瀉病料中分離到一株貓細小病毒的變異株(BJ-22株),其VP2氨基酸序列與FPV的同源性高達98.75%,與CPV的同源性為98.15%�？梢�,FPV宿主感染譜正在不斷擴大,已由最初的貓科動物擴展至非人靈長類,對社會公共衛(wèi)生安全構(gòu)成巨大威脅。本文首先對FPV HH-1/86株細小病毒理化性質(zhì)進行鑒定,并對其全基因組進行測序。在此基礎(chǔ)上構(gòu)建該株細小病毒感染性克隆pFPV,利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將其導(dǎo)入F81細胞,成功拯救獲得帶有遺傳標(biāo)記的重組病毒r FPV。為揭示貓細小病毒高頻率跨物種傳播特征和分子機制提供反向遺傳學(xué)操作平臺;為貓細小病毒跨物種傳播預(yù)警和有效防治提供科學(xué)依據(jù)。該株病毒電鏡下可見直徑20nm左右的立體對稱細小病毒粒子。經(jīng)實驗證實:該病毒在連續(xù)50℃加熱1h、pH3.0作用2h和乙醚作用2h,病毒TCID50升高不到一個對數(shù),表明病毒對熱、酸、乙醚具有一定的耐受性,pH在5.8~6.8 0.015M PBS均能凝集1%豬紅細胞,其中pH 6.5血凝活性最佳。該病毒全基因組長5123nt,C+G的含量為36.35%。3’末端反向重復(fù)序列(Inverted Terminal Repeats,ITR)形成Y型結(jié)構(gòu),長126nt;5’末端ITR形成U型結(jié)構(gòu),長198nt。本實驗利用overlap PCR方法,以病毒基因組片段M1、M2、M3為模板,克隆基因組中間大片段M1+M2+M3,經(jīng)凝膠電泳鑒定正確。通過Infusion克隆技術(shù)將中間片段M1+M2+M3插入含3’和5’端質(zhì)粒pE中。體外定點突變:將2981nt由A→G,產(chǎn)生一個新酶切位點Xho I,構(gòu)建FPV全基因組感染性克隆pFPV。經(jīng)酶切和序列測定證明pFPV正確,用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法,以Lip3000與質(zhì)粒pFPV按7.5μL:3.5μg比例轉(zhuǎn)染F81細胞。轉(zhuǎn)染后72h,細胞出現(xiàn)明顯拉網(wǎng)、脫落等細小病毒細胞病變,將rFPV0三凍三融后按5%同步接毒,第2代后rFPV接毒量降至1%同步接毒,連續(xù)傳代至15代,用于病毒鑒定。通過CPE鑒定、免疫熒光、生長曲線、血凝試驗、western blot試驗,結(jié)果證明,rFPV與親代毒(FPV HH-1/86)病毒學(xué)及生物學(xué)特性沒有明顯差異。本研究為探究貓細小病毒跨物種傳播關(guān)鍵氨基酸位點、揭示貓細小病毒高頻率跨物種傳播分子機理,從而有效防治貓細小病毒跨物種傳播奠定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：貓泛白細胞減少癥病毒 感染性克隆 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法 病毒拯救 病毒鑒定
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-12
• 第一章 引言12-23
• 1.1 細小病毒形態(tài)及理化特征12-13
• 1.2 細小病毒基因組組成及蛋白功能概述13-16
• 1.2.1 細小病毒基因組組成13-14
• 1.2.2 細小病毒非結(jié)構(gòu)蛋白及其功能14-15
• 1.2.3 細小病毒結(jié)構(gòu)蛋白及其功能15-16
• 1.3 細小病毒滾動式復(fù)制16-17
• 1.4 細小病毒受體轉(zhuǎn)鐵蛋白17
• 1.5 FPV、MEV和CPV的進化概述17-19
• 1.6 病毒反向遺傳學(xué)研究概況19-22
• 1.6.1 反向遺傳學(xué)原理19-20
• 1.6.2 反向遺傳學(xué)應(yīng)用20
• 1.6.3 細小病毒反向遺傳系統(tǒng)構(gòu)建20-22
• 1.7 研究內(nèi)容及目的意義22-23
• 第二章 FPV HH-1/86株理化性質(zhì)鑒定及全基因組測序23-33
• 2.1 材料與方法23-26
• 2.1.1 毒株23
• 2.1.2 實驗儀器23
• 2.1.3 試劑23
• 2.1.4 細小病毒電鏡觀察23-24
• 2.1.5 病毒理化特性試驗24
• 2.1.6 細小病毒最適pH范圍試驗24
• 2.1.7 細小病毒基因組DNA提取24
• 2.1.8 病毒中間片段擴增24-25
• 2.1.9 PCR產(chǎn)物末端加堿基A25-26
• 2.1.10 連接pMD19-T載體26
• 2.1.11 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化26
• 2.1.12 病毒末端ITR擴增及連接pMD19-T載體測序26
• 2.2 結(jié)果26-31
• 2.2.1 細小病毒形態(tài)學(xué)鑒定26-27
• 2.2.2 病毒理化性質(zhì)試驗結(jié)果27
• 2.2.3 病毒最適pH范圍試驗結(jié)果27-28
• 2.2.4 病毒基因組PCR擴增電泳結(jié)果28-29
• 2.2.5 NS1和VP2氨基酸序列進化分析29-30
• 2.2.6 HH-1/86株 3’末端Y和 5’末端U功能分析30-31
• 2.3 討論31-33
• 第三章 FPV全長質(zhì)粒pFPV構(gòu)建33-39
• 3.1 材料與方法33-36
• 3.1.1 主要試劑33
• 3.1.2 主要儀器33
• 3.1.3 中間片段overlap PCR33-34
• 3.1.4 PCR產(chǎn)物膠回收34-35
• 3.1.5 定點突變35
• 3.1.6 Dpn I產(chǎn)物轉(zhuǎn)化35
• 3.1.7 質(zhì)粒小提35
• 3.1.8 In-fusionTM實驗35-36
• 3.2 結(jié)果36-38
• 3.2.1 overlap PCR電泳結(jié)果36
• 3.2.2 遺傳標(biāo)記鑒定36-37
• 3.2.3 感染性克隆的構(gòu)建與鑒定37-38
• 3.3 討論38-39
• 第四章 rFPV病毒拯救與鑒定39-48
• 4.1 材料與方法39-42
• 4.1.1 試劑39
• 4.1.2 主要儀器39
• 4.1.3 F81細胞復(fù)蘇與傳代培養(yǎng)39
• 4.1.4 F81細胞瞬時轉(zhuǎn)染實驗39-40
• 4.1.5 rFPV病毒培養(yǎng)40
• 4.1.6 間接免疫熒光實驗40
• 4.1.7 FPV多步生長曲線的繪制40
• 4.1.8 Western Blot實驗40-41
• 4.1.9 遺傳標(biāo)簽酶切鑒定41-42
• 4.1.10 血凝鑒定42
• 4.2 結(jié)果42-47
• 4.2.1 CPE鑒定42-43
• 4.2.2 遺傳標(biāo)記酶切鑒定43-44
• 4.2.3 間接免疫熒光鑒定44-45
• 4.2.4 拯救病毒rFPV增殖特性結(jié)果45-46
• 4.2.5 Western Blot檢測rFPV46
• 4.2.6 血凝鑒定結(jié)果46-47
• 4.3 討論47-48
• 第五章 全文結(jié)論48-49
• 5.1 結(jié)論48
• 5.2 展望48-49
• 參考文獻49-54
• 致謝54-55
• 作者簡介55-56

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前6條

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本文編號：741905