本文關(guān)鍵詞：CaMKⅡ在鎘致原代大鼠成骨細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑中的作用

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【摘要】：鎘作為廣泛存在的重金屬污染物,通常以鎘離子的形式通過鈣離子泵、離子通道型受體等進(jìn)入細(xì)胞,進(jìn)而影響胞內(nèi)鈣離子分布。胞內(nèi)鈣離子濃度改變引起CaMK Ⅱ表達(dá)水平的變化以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。而CaMK Ⅱ在成骨細(xì)胞凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的作用鮮有報(bào)道。為了研究鎘致鈣穩(wěn)態(tài)失衡引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激產(chǎn)生的影響,原代成骨細(xì)胞暴露于鎘及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子通道抑制劑2-APB,流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度,RTCA檢測(cè)細(xì)胞存活率,蛋白免疫印跡法檢測(cè)UPR相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明2 μmol/L醋酸鎘、50μmol/L 2-APB及其共處理成骨細(xì)胞后,與對(duì)照組相比,鎘處理導(dǎo)致細(xì)胞存活率顯著降低,且伴隨著細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高(P0.01); 2-APB與鎘共處理組和鎘處理組相比,細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度顯著降低(P＜0.01)；不同濃度的醋酸鎘(0、0.25、0.5、1、2、5、10μmol/L)處理6h或2μmol/L醋酸鎘處理成骨細(xì)胞不同時(shí)間(0、0.5、1、5、10、30 min或2、4、6 h)后,與對(duì)照組相比,2μmol/L醋酸鎘處理成骨細(xì)胞6小時(shí)能顯著提高BiP、ATF4、CHOP三個(gè)蛋白的表達(dá)水平(P)＜0.05或P＜0.01)。為了研究鎘對(duì)成骨細(xì)胞CaMKⅡ表達(dá)的影響及CaMKⅡ在鎘致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的作用,原代成骨細(xì)胞暴露于鎘、2-APB或CaMKⅡ抑制劑KN93, RTCA檢測(cè)細(xì)胞存活率,蛋白免疫印跡法檢測(cè)CaMKⅡ、P-CaMKⅡ和UPR相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明與對(duì)照組相比,2μmol/L醋酸鎘處理成骨細(xì)胞6小時(shí)能顯著提高CaMKⅡ的磷酸化水平；與鎘處理組相比,2-APB與鎘共處理組顯著降低CaMKⅡ的磷酸化水平;而KN93與鎘共處理組顯著提高細(xì)胞存活率,且顯著降低了ATF4和CHOP蛋白的表達(dá)(P＜0.05或P＜0.01)。為了研究鎘致成骨細(xì)胞凋亡的過程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和CaMKⅡ的作用,成骨細(xì)胞暴露于鎘、2-APB或KN93,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,雙苯酰亞胺(Hoechst 33258)染色觀察細(xì)胞核形態(tài),蛋白免疫印跡法檢測(cè)Caspase-12、3, Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明2 μmol/L鎘暴露成骨細(xì)胞6h后,細(xì)胞凋亡率、Caspase-12、3蛋白活化水平和Bax/Bcl-2水平極顯著高于對(duì)照組(P0.01); 2-APB與鎘共處理組以及KN93與鎘共處理組細(xì)胞凋亡率、Caspase-12、3蛋白活化水平和Bax/Bcl-2水平極顯著低于鎘處理組(P0.01); Hoechst 33258染色結(jié)果與上述一致。綜上所述,鎘通過引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放鈣離子造成胞漿鈣超載,誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng),最后通過Caspase-12、3以及BCL-2家族蛋白途徑導(dǎo)致原代大鼠成骨細(xì)胞凋亡；CaMKⅡ參與這個(gè)過程并發(fā)揮重要作用。
【關(guān)鍵詞】：鎘 成骨細(xì)胞 細(xì)胞凋亡 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.3
【目錄】：

• 摘要3-4
• ABSTRACT4-6
• 縮略表6-11
• 第一部分 文獻(xiàn)綜述11-26
• 第一章 鎘致骨骼毒性的研究進(jìn)展11-16
• 1. 鎘致骨骼毒性的流行病學(xué)研究11-12
• 2. 鎘致骨毒性的機(jī)制12-16
• 2.1 鎘間接致骨毒性12-13
• 2.2 鎘直接致骨毒性13-14
• 2.3 鎘致骨毒性與其他微量元素的關(guān)系14-16
• 第二章 細(xì)胞凋亡中鎘和鈣的相互作用16-21
• 1. 鎘與鈣及其相關(guān)蛋白16-19
• 1.1 鎘與鈣穩(wěn)態(tài)16-17
• 1.2 鎘對(duì)鈣調(diào)蛋白的作用17-18
• 1.3 鎘對(duì)CaMKⅡ的作用18-19
• 2. 鎘與細(xì)胞凋亡19-21
• 2.1 鎘對(duì)細(xì)胞凋亡的影響19
• 2.2 鎘對(duì)鈣蛋白酶的影響19
• 2.3 鈣調(diào)蛋白在細(xì)胞凋亡中的作用19-21
• 第三章 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在細(xì)胞凋亡過程中的作用21-25
• 1. 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與細(xì)胞凋亡21-22
• 2. 鎘誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激22-23
• 3. 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和UPR調(diào)節(jié)鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡23-25
• 本研究的目的與意義25-26
• 第二部分 試驗(yàn)研究26-63
• 第一章 鎘致成骨細(xì)胞鈣超載及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣穩(wěn)態(tài)失衡引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激26-34
• 1. 材料26-27
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物26
• 1.2 主要儀器26-27
• 1.3 主要試劑及材料27
• 2. 方法27-29
• 2.1 溶液配制27
• 2.2 SD大鼠成骨細(xì)胞的準(zhǔn)備27-28
• 2.2.1 成骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)27-28
• 2.2.2 成骨細(xì)胞的消化傳代28
• 2.3 細(xì)胞存活率監(jiān)測(cè)28
• 2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度28
• 2.5 免疫印跡檢測(cè)成骨細(xì)胞中BiP、ATF4、CHOP蛋白表達(dá)28-29
• 2.5.1 細(xì)胞處理28-29
• 2.5.2 蛋白樣品制備29
• 2.5.3 免疫印跡29
• 2.6 數(shù)據(jù)分析29
• 3. 結(jié)果29-33
• 3.1 鎘對(duì)細(xì)胞存活率、細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響及2-APB的保護(hù)效應(yīng)29-31
• 3.2 鎘對(duì)原代大鼠成骨細(xì)胞UPR蛋白表達(dá)的影響31-33
• 3.2.1 鎘暴露不同時(shí)間段對(duì)細(xì)胞UPR蛋白表達(dá)的影響31
• 3.2.2 不同濃度鎘對(duì)原代大鼠成骨細(xì)胞UPR蛋白表達(dá)的影響31-33
• 4. 討論33-34
• 第二章 鎘致成骨細(xì)胞CaMKⅡ表達(dá)水平變化及其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的作用34-40
• 1. 材料34
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物34
• 1.2 主要儀器34
• 1.3 主要試劑及材料34
• 2. 方法34-35
• 2.1 細(xì)胞培養(yǎng)34
• 2.2 免疫印跡檢測(cè)成骨細(xì)胞中CaMKⅡ、BiP、ATF4、CHOP蛋白表達(dá)34
• 2.3 數(shù)據(jù)分析34-35
• 3. 結(jié)果35-38
• 3.1 鎘對(duì)原代大鼠成骨細(xì)胞CaMKⅡ蛋白表達(dá)的影響35-36
• 3.2 鎘及2-APB對(duì)原代大鼠成骨細(xì)胞CaMKⅡ蛋白表達(dá)水平的影響36
• 3.3 鎘及KN93對(duì)原代大鼠成骨細(xì)胞細(xì)胞活性及UPR蛋白表達(dá)水平的影響36-38
• 4. 討論38-40
• 第三章 CaMKⅡ在鎘致成骨細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引發(fā)細(xì)胞調(diào)亡過程中的作用40-49
• 1. 材料40
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物40
• 1.2 主要儀器40
• 1.3 主要試劑及材料40
• 2. 方法40-41
• 2.1 細(xì)胞核熒光染色40-41
• 2.2 Annexin V-FITC流式細(xì)胞檢測(cè)41
• 2.3 Western Blot分析凋亡蛋白表達(dá)41
• 2.4 數(shù)據(jù)分析41
• 3. 結(jié)果41-47
• 3.1 鎘及2-APB對(duì)原代大鼠成骨細(xì)胞Caspase蛋白表達(dá)的影響41-42
• 3.2 鎘及KN93對(duì)原代大鼠成骨細(xì)胞Caspase蛋白表達(dá)的影響42-43
• 3.3 鎘及2-APB或KN93對(duì)成骨細(xì)胞凋亡水平的影響43-47
• 3.3.1 鎘及2-APB或KN93對(duì)成骨細(xì)胞凋亡率的影響43-44
• 3.3.2 鎘及2-APB或KN93對(duì)成骨細(xì)胞核形態(tài)的影響44-45
• 3.3.3 鎘及2-APB或KN93對(duì)成骨細(xì)胞BCL2家族蛋白表達(dá)的影響45-47
• 4. 討論47-49
• 全文結(jié)論49-50
• 參考文獻(xiàn)50-63
• 致謝63-64
• 攻讀學(xué)位期間論文發(fā)表情況64-65

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：731320