本文關鍵詞：轉內切葡聚糖酶乳酸桿菌的構建及其對獺兔生產性能和免疫性能的影響

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【摘要】：動物飼料中含有大量的纖維素,其特殊的結構很難被動物胃腸道降解吸收而隨糞便排出。動物腸道內某些微生物通過產生纖維素酶來幫助降解纖維素。因此,篩選生長快、產酶活力高的纖維素分解細菌,是得到纖維素酶的一個有效方法。乳酸菌存在于動物腸道中,通過競爭或產生乳酸等代謝產物來拮抗有害微生物的快速增殖,從而提高動物的生長和免疫能力,是抗生素的有效替代物。本試驗分別從獺兔盲腸和回腸內容物中分離出高產纖維素酶的細菌和乳酸桿菌,并對所篩選的產纖維素酶的菌株進行種屬鑒定,研究纖維素酶產生菌的酶學性質,并將纖維素酶產生菌的內切葡聚糖酶基因克隆到植物乳桿菌感受態(tài)細胞中,構建具有纖維素酶活性的植物乳桿菌。飲水添加給30日齡斷奶獺兔,研究其對30日齡斷奶獺兔生長性能和免疫性能的影響,為內切葡聚糖酶植物乳桿菌在獺兔生產中的應用提供依據。本試驗研究結果如下:1從獺兔盲腸和回腸腸道內分別篩選出一株高產纖維素酶的細菌和乳酸桿菌,經鑒定分別是枯草芽孢桿菌和植物乳酸桿菌�？莶菅挎邨U菌在pH為7.0的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h,產纖維素酶酶活性最高;其所產纖維素酶在溫度為60℃、pH為7.0的條件下,分解纖維素的能力最高。該酶在pH 4.0~8.0的范圍內依然表現出一定的水解能力。2利用引物擴增枯草芽孢桿菌的內切葡聚糖酶基因,將內切葡聚糖酶基因與表達載體pLEM415連接后電轉化入植物乳桿菌感受態(tài)細胞中,構建轉內切葡聚糖酶乳酸桿菌(L.plantarum pLEM-cel)。經檢測,該L.plantarum pLEM-cel具有0.046U/mL的纖維素酶活性。3選取60只30日齡健康獺兔,隨機分為A、B、C 3組,每組20只,每只為一個重復。其中A組飲水添加10mL 107 cfu/mL L.plantarum pLEM-cel,B組飲水添加10mL107 cfu/mL植物乳桿菌,C組為對照組,飲水添加10mL滅菌的冷凍保護劑(配方見附錄6)。兩天一次。預飼期4 d,正飼期31 d。正飼期結束后每組選擇10只進行屠宰采樣,檢測生產和免疫指標。結果發(fā)現,內切葡聚糖酶植物乳桿菌組獺兔的料重比顯著低于對照組,內切葡聚糖酶植物乳桿菌組獺兔的的全凈膛率、胸腺指數、十二指腸絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度、回腸絨毛高度、血清IgG和腸粘膜SIgA含量顯著均高于對照組。結果表明,轉內切葡聚糖酶乳酸桿菌能顯著降低獺兔的料重比,提高獺兔的生產性能,同時可以顯著提高獺兔的全凈膛率和免疫能力。綜上所述,本試驗構建的內切葡聚糖酶植物乳桿菌能夠提高獺兔的生長和免疫性能。
【關鍵詞】：獺兔 纖維素酶 植物乳桿菌 轉內切葡聚糖酶乳酸桿菌
【學位授予單位】：西北農林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S829.1
【目錄】：

• 摘要6-8
• abstract8-13
• 第一章 文獻綜述13-26
• 1.1 纖維素13-14
• 1.2 纖維素酶14-21
• 1.2.1 纖維素酶的酶切機制14-15
• 1.2.2 纖維素酶在動物生產上的應用15-17
• 1.2.3 纖維素分解菌17-21
• 1.3 乳酸桿菌21-23
• 1.3.1 乳酸桿菌的簡介21-22
• 1.3.2 植物乳桿菌22
• 1.3.3 乳酸桿菌與植物乳桿菌在動物中的應用22-23
• 1.4 轉基因細菌的研究進展23-24
• 1.5 研究的目的與意義24-26
• 第二章 兔源纖維素分解菌與乳酸桿菌的分離鑒定26-40
• 2.1 材料與方法26-29
• 2.1.1 樣品來源26
• 2.1.2 培養(yǎng)基與試劑26-27
• 2.1.3 纖維素分解菌的分離篩選27
• 2.1.4 乳酸桿菌的篩選鑒定27
• 2.1.5 纖維素酶活力的測定27
• 2.1.6 纖維素分解菌及乳酸桿菌的種屬鑒定27-28
• 2.1.7 乳酸菌感受態(tài)細胞的制備28
• 2.1.8 纖維素分解菌生長條件和產酶能力的研究28
• 2.1.9 纖維素酶酶反應條件的研究28-29
• 2.2 結果與分析29-37
• 2.2.1 纖維素分解細菌的篩選29
• 2.2.2 標準曲線的繪制29-30
• 2.2.3 纖維素分解菌的種屬鑒定30-33
• 2.2.4 乳酸菌的種屬鑒定33-35
• 2.2.5 纖維素分解菌生長條件和產酶能力的研究35-36
• 2.2.6 纖維素酶酶反應條件的研究36-37
• 2.3 討論37-39
• 2.3.1 纖維素分解菌的分離鑒定37-38
• 2.3.2 纖維素分解菌產酶條件和酶學特性的研究38
• 2.3.3 乳酸桿菌的分離鑒定38-39
• 2.4 小結39-40
• 第三章 轉內切葡聚糖酶基因乳酸桿菌的構建40-46
• 3.1 材料與方法40-42
• 3.1.1 菌株與質粒40
• 3.1.2 試驗試劑40
• 3.1.3 試驗引物40-41
• 3.1.4 內切葡聚糖酶基因的PCR擴增41
• 3.1.5 膠回收41
• 3.1.6 連接T載體及細菌轉化41
• 3.1.7 質粒的提取及鑒定41-42
• 3.1.8 質粒p MD-19T-JT與穿梭載體p LEM415的雙酶切與連接42
• 3.1.9 轉內切葡聚糖酶基因乳酸桿菌的構建42
• 3.1.10 轉內切葡聚糖酶基因乳酸桿菌的檢測42
• 3.2 結果與分析42-44
• 3.2.1 內切葡聚糖酶基因的克隆42-43
• 3.2.2 轉內切葡聚糖酶基因乳酸桿菌的構建43
• 3.2.3 轉內切葡聚糖酶基因乳酸桿菌酶活性分析43-44
• 3.3 討論44-45
• 3.3.1 內切葡聚糖酶基因的克隆44
• 3.3.2 轉內切葡聚糖酶基因乳酸桿菌的構建與檢測44-45
• 3.4 小結45-46
• 第四章 乳酸桿菌工程菌對獺兔生產性能與免疫性能的影響46-53
• 4.1 材料與方法46-48
• 4.1.1 試驗動物與試驗菌株46
• 4.1.2 試驗設計46
• 4.1.3 試驗日糧46-47
• 4.1.4 飼養(yǎng)管理47
• 4.1.5 試驗指標的測定與方法47-48
• 4.1.6 數據處理48
• 4.2 結果與分析48-50
• 4.2.1 轉內切葡聚糖酶基因乳酸桿菌對獺兔生長性能與屠宰性能的影響48-49
• 4.2.2 轉內切葡聚糖酶基因乳酸桿菌對獺兔免疫性能的影響49-50
• 4.3 討論50-52
• 4.3.1 轉內切葡聚糖酶基因乳酸桿菌對獺兔生產性能與屠宰性能的影響50-52
• 4.3.2 轉內切葡聚糖酶基因乳酸桿菌對獺兔免疫性能的影響52
• 4.4 小結52-53
• 第五章 研究結論與創(chuàng)新點53-54
• 5.1 研究結論53
• 5.2 創(chuàng)新點53
• 5.3 有待進一步研究的內容53-54
• 參考文獻54-62
• 附錄62-65
• 致謝65-66
• 作者簡介66

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