本文關(guān)鍵詞：精氨酸調(diào)控酪蛋白表達途徑相關(guān)miRNAs的篩選與表達分析

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【摘要】：功能性氨基酸——精氨酸(Arg)對奶牛乳腺上皮細胞酪蛋白的合成有一定的促進作用,本課題組前期研究了精氨酸調(diào)控乳腺上皮細胞酪蛋白合成途徑中的相關(guān)因子和其功能基因,在此基礎(chǔ)上,本研究將進一步探索精氨酸影響奶牛乳腺酪蛋白表達的miRNA分子機制。研究包括以下四個方面部分。試驗一精氨酸途徑調(diào)控酪蛋白表達miRNA的預(yù)測該試驗通過PicTar和TargetScan兩種可以預(yù)測靶定目標基因的網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫進行預(yù)測篩選,對精氨酸調(diào)控酪蛋白合成通徑相關(guān)功能基因的表達起調(diào)控作用的miRNA入手,通過網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫預(yù)測對精氨酸調(diào)控酪蛋白合成通徑相關(guān)功能基因起調(diào)作用的miRNAs。結(jié)果顯示：通過將兩種數(shù)據(jù)庫的預(yù)測結(jié)果進行比對,篩選出精氨酸調(diào)控酪蛋白合成通徑中mmu-miR-325、mmu-miR-3062、mmu-miR-471-3等53個候選miRNAs可能對酪蛋白的合成具有調(diào)控作用。試驗二體外法檢測精氨酸途徑調(diào)控酪蛋白合成的重要miRNAs本試驗采用本實驗室儲備的二代奶牛乳腺上皮細胞,添加精氨酸進行體外培養(yǎng),根據(jù)添加的精氨酸的量分為0倍組、1倍組、2倍組,采用RT-PCR方法檢測所篩選出精氨酸調(diào)控酪蛋白合成途徑相關(guān)的候選miRNAs的表達情況。結(jié)果顯示：所篩選出的候選miRNAs中有9條：mmu-miR-743a、mmu-miR-543、mmu-miR-101a、mmu-miR-760-3p、 mmu-miR-1954、mmu-miR-712、mmu-miR-574-5p、mmu-miR-468及mmu-miR-875-3p在精氨酸組和對照組間差異顯著。提示這9條候選的miRNAs可能對精氨酸調(diào)控酪蛋白合成途徑中相關(guān)功能基因的表達起調(diào)控作用進而影響乳腺上皮細胞酪蛋白的合成。試驗三精氨酸灌注對奶牛乳腺酪蛋白合成和miRNAs表達的影響本試驗選擇6頭體重、胎次(4胎)、泌乳期(80±2d)、泌乳量(21.0±1.0 kg)體況(3.0)等基本一致的荷斯坦奶牛作為試驗動物,分3組,分別為：對照組、精氨酸組、丙氨酸組,每組2頭試驗牛,采用3×3復(fù)拉丁方試驗設(shè)計,進行頸靜脈灌注。結(jié)果顯示：灌注精氨酸組牛奶中乳蛋白含量和乳品質(zhì)均有提高；酪蛋白的合成量有所提高,CSN1S1、CSN1S2的表達量顯著提高；另外,體外法檢測出的差異miRNAs中mmu-miR-743a、mmu-miR-543、mmu-miR-760-3p、mmu-miR-1954、mmu-miR-712、 mmu-miR-574-5p都在精氨酸組較高(P0.05)；但miR-468在精氨酸組較低(P0.05)。提示精氨酸可能通過影響酪蛋白合成途徑這8條候選miRNAs表達的機制來影響酪蛋白合成通路相關(guān)基因的表達而最終調(diào)控酪蛋白的合成。試驗四頸靜脈灌注精氨酸對泌乳中期奶牛氮代謝及免疫性能的影響本試驗主要研究頸靜脈灌注精氨酸對奶牛養(yǎng)分消化、氮代謝和免疫性能的影響。試驗設(shè)計同試驗三。結(jié)果表明,乳蛋白氮產(chǎn)量在3組之間的差異顯著(P0.05),以精氨酸組最高,丙氨酸組次之,對照組最低。乳蛋白氮占攝入氮比例也以精氨酸組最高,但組間差異不顯著(P0.05)。代謝氮占攝入氮比例為精氨酸組對照組丙氨酸組。精氨酸組顯著提高了血清中免疫球蛋白IgG濃度、血漿中總蛋白的濃度及白蛋白與球蛋白比例(P0.05)；而谷丙轉(zhuǎn)氨酶及谷草轉(zhuǎn)氨酶等指標不受灌注的影響；同時,該組血清中IL-1、TNF-a水平也較高(P0.05)�？偨Y(jié)而言：頸靜脈灌注精氨酸可通提高奶牛對氮的消化與利用來提高其乳蛋白的合成量；同時提高了奶牛血液中總蛋白、免疫球蛋白IgG及細胞因子IL-1等的水平,有利于提高奶牛機體的免疫能力和胎兒被動的免疫力。
【關(guān)鍵詞】：精氨酸灌注 奶牛 調(diào)控 酪蛋白合成 miRNA
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S823
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-11
• 符號說明11-13
• 第一章 文獻綜述13-26
• 1.1 精氨酸營養(yǎng)研究進展13
• 1.2 精氨酸的理化性質(zhì)13-14
• 1.3 精氨酸的吸收與合成代謝14-16
• 1.3.1 精氨酸的合成14-15
• 1.3.2 精氨酸的分解代謝15-16
• 1.4 精氨酸在動物生產(chǎn)中的應(yīng)用16-18
• 1.4.1 精氨酸對動物生長性能的影響16-17
• 1.4.2 精氨酸對動物屠宰性能的影響17
• 1.4.3 精氨酸對動物繁殖性能的影響17-18
• 1.4.4 精氨酸對動物機體免疫功能的影響18
• 1.5 奶牛乳蛋白的合成及調(diào)控通路18-22
• 1.5.1 乳蛋白的組成18-19
• 1.5.2 乳蛋白的合成19
• 1.5.3 調(diào)控乳蛋白合成的信號通路19-22
• 1.6 精氨酸與乳蛋白合成22-23
• 1.7 miRNA對泌乳生理的調(diào)控23-25
• 1.7.1 miRNA的發(fā)生及作用機制23-24
• 1.7.2 miRNA對泌乳生理的調(diào)控24-25
• 1.8 本課題立題依據(jù)與意義25-26
• 第二章 精氨酸途徑調(diào)控酪蛋白表達miRNA的預(yù)測26-30
• 2.1 材料與方法26-28
• 2.1.1 數(shù)據(jù)庫預(yù)測及結(jié)果獲取27-28
• 2.2 結(jié)果與分析28-29
• 2.3 討論29
• 2.4 小結(jié)29-30
• 第三章 體外法檢測精氨酸途徑調(diào)控酪蛋白合成的重要的miRNAs30-41
• 3.1 材料與方法30-33
• 3.1.1 復(fù)蘇第2代奶牛乳腺上皮細胞30
• 3.1.2 試驗設(shè)計與方法30-33
• 3.1.3 統(tǒng)計與分析33
• 3.2 結(jié)果與分析33-38
• 3.2.1 酪蛋白基因表達鑒定結(jié)果33
• 3.2.2 miRNA的RT-qPCR結(jié)果分析33-34
• 3.2.3 穩(wěn)定表達的miRNA在各處理中表達34-37
• 3.2.4 目標miRNA在各處理中相對表達結(jié)果37-38
• 3.3 討論38-40
• 3.4 小結(jié)40-41
• 第四章 精氨酸灌注對奶牛乳腺酪蛋白合成和miRNAs表達的影響41-61
• 4.1 材料與方法41-48
• 4.1.1 試驗動物41-42
• 4.1.2 儀器設(shè)備42-43
• 4.1.3 主要試劑和材料43
• 4.1.4 試驗方法43-48
• 4.2 結(jié)果與分析48-56
• 4.2.1 精氨酸灌注對乳品質(zhì)動態(tài)變化的影響48-50
• 4.2.2 精氨酸灌注對酪蛋白含量動態(tài)變化的影響50-52
• 4.2.3 總RNA的純度與完整性52-53
• 4.2.4 目的基因和內(nèi)參基因的擴增曲線和熔解曲線53-54
• 4.2.5 精氨酸灌注對酪蛋白基因表達的影響54
• 4.2.6 精氨酸灌注對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因表達的影響54-55
• 4.2.7 精氨酸灌注對酪蛋白合成途徑miRNA表達的影響55-56
• 4.3 討論56-59
• 4.3.1 精氨酸灌注對牛奶蛋白合成的影響56-57
• 4.3.2 精氨酸灌注對牛奶酪蛋白含量的影響57-58
• 4.3.3 精氨酸調(diào)控酪蛋白基因表達的miRNA機制58-59
• 4.4 小結(jié)59-61
• 第五章 頸靜脈灌注精氨酸對泌乳中期奶牛氮代謝及免疫性能的影響61-69
• 5.1 材料與方法61-63
• 5.1.1 試驗動物及試驗設(shè)計61
• 5.1.2 儀器設(shè)備61
• 5.1.3 樣品的采集61-62
• 5.1.4 試驗方法62-63
• 5.1.5 統(tǒng)計分析63
• 5.2 結(jié)果與分析63-66
• 5.2.1 養(yǎng)分表觀消化率63-64
• 5.2.2 氮平衡64-65
• 5.2.3 對泌乳奶牛血清中免疫球蛋白的影響65-66
• 5.2.4 對泌乳奶牛血液生化指標的影響66
• 5.2.5 對泌乳奶牛血清中IL-1,IL-6及TNF-α水平的影響66
• 5.3 討論66-68
• 5.3.1 精氨酸灌注對奶牛氮代謝的影響66-68
• 5.3.2 將氨酸灌注對奶牛免疫性能的影響68
• 5.4 小結(jié)68-69
• 第六章 全文結(jié)論69-71
• 6.1 全文結(jié)論69-70
• 6.2 創(chuàng)新點70
• 6.3 進一步要研究的問題70-71
• 參考文獻71-83
• 致謝83-84
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文84-85

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