本文關(guān)鍵詞：甘氨酰tRNA合成酶對奶牛乳腺上皮細胞乳合成及細胞增殖的影響

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【摘要】：隨著人們對食品安全認識的不斷加深,使得乳品質(zhì)的好壞和產(chǎn)奶量的高低得到更廣泛的關(guān)注。研究泌乳相關(guān)信號通路,探尋與泌乳相關(guān)的重要調(diào)控分子,有利于為奶牛乳品質(zhì)和乳產(chǎn)量的提高,提供實驗依據(jù)及新途徑。甘氨酰tRNA合成酶(glycyl-t RNA synthetase,GlyRS)是重要的氨基酰tRNA合成酶(aminoacyl-t RNA synthetases,aa RSs)家族成員。研究發(fā)現(xiàn)aa RSs存在多種經(jīng)典翻譯功能之外的信號調(diào)控作用。但是,目前國內(nèi)外關(guān)于GlyRS在奶牛乳腺發(fā)育過程中表達及調(diào)節(jié)的研究尚未見報道。本實驗室前期發(fā)現(xiàn)GlyRS與BMECs乳蛋白的合成有關(guān)。本實驗旨在闡明GlyRS對奶牛乳腺上皮細胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)乳蛋白、乳脂、乳糖以及細胞增殖的影響。從而初步揭示GlyRS是一個新的調(diào)節(jié)BMECs乳合成的信號分子。本研究采用了組織塊培養(yǎng)法,體外培養(yǎng)并得到了純化的BMECs。利用免疫熒光(immunofluorescence,IF)和蛋白質(zhì)免疫印記(western blotting,WB)檢測細胞中角蛋18(CK18)和β-Casein(CSN2)的表達,以鑒定細胞的純度和泌乳功能。實驗通過在細胞培養(yǎng)液中添加0.6mmol/L的蛋氨酸(methionine,Met)或10%的胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)建立一個體外細胞培養(yǎng)的泌乳模型。采用WB、IF以及實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)等方法,檢測添加Met或FBS后,乳糖和乳脂(triglyceride,TG)的分泌量,DNA數(shù)量,CSN2、GlyRS、p-GlyRS(T544,S704)的表達量以及p-GlyRS(T544,S704)的定位情況。結(jié)果表明,添加Met或FBS可以促進細胞乳糖和乳脂的分泌(p0.05),增加DNA合成,顯著提高CSN2、GlyRS以及p-GlyRS(T544,S704)的表達量(p0.05),同時發(fā)現(xiàn)p-GlyRS(T544,S704)在細胞核中定位明顯增加。這表明,在Met或FBS可以通過GlyRS調(diào)節(jié)BMECs乳合成以及細胞增殖。利用純化后的BMECs分別建立GlyRS過表達(pGCMV-IRES-EGFP-GlyRS)與干擾(GlyRS shRNA)的細胞泌乳模型,采用WB、IF、qRT-PCR和流式細胞術(shù)(flow cytometry,FCM)等方法,檢測乳糖和乳脂的分泌量,DNA數(shù)量,細胞周期的分布以及GlyRS、p-GlyRS(T544)、p-GlyRS(S704)、mTOR、p-mTOR、S6K1、p-S6K1、SREBP-1、CSN2、Cyclin D1和β-1,4-galactosyltransferase2(β4Gal-T2)的表達。結(jié)果表明,當GlyRS過表達和抑制時,乳糖和乳脂的分泌量,細胞的DNA合成,處于S期和G2/M期的細胞數(shù)分別顯著增加和降低(p0.05)。同時,GlyRS、p-GlyRS(T544)、p-Gly RS(S704)、p-mTOR、p-S6K1、SREBP-1、Cyclin D1和CSN2的蛋白表達水平以及β4Gal-T2的mRNA表達量也均顯著增加和降低(p0.05)。然而,mTOR和S6K1的蛋白表達水平無顯著變化(p0.05)。這表明,GlyRS通過上調(diào)p-GlyRS(T544)、p-GlyRS(S704)、p-mTOR、p-S6K1、SREBP-1、Cyclin D1以及β4Gal-T2的表達量,促進乳蛋白、乳脂以及乳糖的合成,同時提高BMECs增殖能力。綜上所述,GlyRS作為一個重要的信號分子,能接受營養(yǎng)物質(zhì)(如Met,FBS)信號,正向調(diào)節(jié)BMECs的乳合成以及細胞增殖。其可能的調(diào)控機制如下:當GlyRS接受Met或FBS刺激后,其磷酸化蛋白水平增加,進入細胞核量增多,通過上調(diào)p-mTOR、p-S6K1、SREBP-1、β4Gal-T2以及Cyclin D1的表達,促進BMECs乳合成以及細胞增殖。
【關(guān)鍵詞】：奶牛乳腺上皮細胞 甘氨酰tRNA合成酶 乳合成 細胞增殖
【學位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S823
【目錄】：

• 摘要10-12
• 英文摘要12-14
• 1 引言14-22
• 1.1 乳腺上皮細胞乳合成和細胞增殖的基本規(guī)律14-15
• 1.1.1 乳蛋白的合成14
• 1.1.2 乳脂合成14
• 1.1.3 乳糖合成14-15
• 1.1.4 MECs的增殖15
• 1.2 調(diào)控BMECs乳合成的細胞信號轉(zhuǎn)導途徑15-19
• 1.2.1 mTOR途徑對乳蛋白和乳脂合成的調(diào)控15-16
• 1.2.2 SREBP-1 途徑對乳脂合成的調(diào)控16-17
• 1.2.3 β4GalT對乳糖合成的調(diào)控17
• 1.2.4 Cyclin D1對MECs增殖的調(diào)控17
• 1.2.5 外源激素、生長因子和營養(yǎng)素對乳合成和細胞增殖的調(diào)控17-19
• 1.3 氨基酰tRNA合成酶19-20
• 1.3.1 氨基酰tRNA合成酶的基本結(jié)構(gòu)19
• 1.3.2 aaRSs的非經(jīng)典功能19-20
• 1.3.3 甘氨酰tRNA合成酶的非經(jīng)典功能20
• 1.4 實驗的目的與意義20-22
• 2 材料與方法22-35
• 2.1 實驗材料22-25
• 2.1.1 主要實驗試劑22-23
• 2.1.2 主要實驗儀器23
• 2.1.3 實驗動物與細胞23-24
• 2.1.4 試劑的配制24-25
• 2.2 實驗方法與步驟25-35
• 2.2.1 BMECs的原代培養(yǎng)與純化25-26
• 2.2.2 BMECs的鑒定26-28
• 2.2.3 添加Met、FBS的BMECs泌乳模型的建立28
• 2.2.4 過表達GlyRS的BMECs泌乳模型的建立28-29
• 2.2.5 抑制GlyRS的BMECs泌乳模型的建立29-32
• 2.2.6 添加Met、FBS后對BMECs乳合成以及細胞增殖的影響32-33
• 2.2.7 GlyRS過表達后對BMECs乳合成以及細胞增殖的影響33-34
• 2.2.8 GlyRS抑制后對BMECs乳合成以及細胞增殖的影響34
• 2.2.9 數(shù)據(jù)處理34-35
• 3 結(jié)果與分析35-54
• 3.1 BMECs的原代培養(yǎng)35-36
• 3.2 加Met、FBS后對BMECs乳合成以及細胞增殖的影響36-42
• 3.2.1 加Met、FBS后對BMECs乳糖分泌的影響36-37
• 3.2.2 加Met、FBS后對BMECs TG分泌的影響37-38
• 3.2.3 加Met、FBS后對BMECs增殖的影響38-39
• 3.2.4 Met、FBS調(diào)節(jié)BMECs中相關(guān)基因的表達39-40
• 3.2.5 加Met、FBS后對p-GlyRS核定位的影響40-42
• 3.3 GlyRS過表達后可上調(diào)BMECs的乳合成及細胞增殖42-46
• 3.3.1 GlyRS過表達后增加BMECs乳糖的分泌42
• 3.3.2 GlyRS過表達后增加BMECsTG的分泌42-43
• 3.3.3 GlyRS過表達后促進DNA合成及加快細胞周期轉(zhuǎn)換43-45
• 3.3.4 GlyRS過表達后增加β4Gal-T2的mRNA表達量45
• 3.3.5 GlyRS過表達后增加相關(guān)蛋白的表達45-46
• 3.4 GlyRS抑制后可下調(diào)BMECs的乳合成及細胞增殖46-54
• 3.4.1 GlyRS干擾片段的篩選46-48
• 3.4.2 GlyRS抑制后減少BMECs乳糖的分泌48-49
• 3.4.3 GlyRS抑制后減少BMECs 中TG的分泌49-50
• 3.4.4 GlyRS抑制后減少DNA合成及減緩細胞周期轉(zhuǎn)換50-52
• 3.4.5 GlyRS抑制后降低β4Gal-T2的mRNA表達量52
• 3.4.6 GlyRS抑制后降低相關(guān)蛋白水平的表達52-54
• 4 討論54-59
• 4.1 BMECs的原代培養(yǎng)、純化及鑒定54
• 4.2 Met和FBS對BMECs乳合成及細胞增殖的影響54-56
• 4.2.1 Met和FBS對乳蛋白、乳脂及乳糖合成的影響54-55
• 4.2.2 Met和FBS對BMECs增殖能力的影響55
• 4.2.3 Met和FBS對GlyRS表達的影響55
• 4.2.4 Met和FBS對p-GlyRS表達及入核的影響55-56
• 4.3 GlyRS對BMECs乳合成以及細胞增殖的影響56-59
• 4.3.1 GlyRS對BMECs乳蛋白合成的影響56
• 4.3.2 GlyRS對BMECs乳脂合成的影響56
• 4.3.3 GlyRS對BMECs乳糖合成的影響56-57
• 4.3.4 GlyRS過表達與抑制對p-GlyRS表達的影響57
• 4.3.5 GlyRS對細胞增殖的影響57-59
• 5 結(jié)論59-60
• 致謝60-61
• 參考文獻61-68
• 附錄68-70
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表學術(shù)論文70

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1 陸玲,黃為一,袁生,樊慶笙;鈣在粟酒裂殖酵母細胞增殖過程中的效應[J];南京農(nóng)業(yè)大學學報;2000年02期

2 闞飛;孫捷;田路e，

本文編號：656127